» Laboratoire de pathologie IMMUNOHISTOCHIMIE

IMMUNOHISTOCHIMIE


Combinaison de l’immunologie et de l’histochimie, elle a 3 buts essentiels :
- confirmer ou préciser l’origine du cancer primitif du patient ;
- identifier des cellules cancéreuses très indifférenciées ;
- donner des facteurs pronostiques ou prédictifs (récepteurs hormonaux, Her2, Ki67 (prolifération cellulaire), CD34 ou CD 31 en recherche pour la néo-angiogenèse.
 
Méthode streptavidine-peroxydase : Elle consiste à mettre en évidence un antigène grâce à la fixation d’un anticorps primaire puis celle d’un anticorps secondaire biotinylé. Ce deuxième anticorps fixe ensuite la streptavidine (avidine élaborée par Streptomyces avidinii) complexée à de la peroxydase grâce à la grande affinité de la streptavidine pour la biotine (Figure 9).
Méthode enzyme- antienzyme : Dans ces méthodes, l’anticorps secondaire fixe à la fois l’anticorps primaire et le complexe enzyme-antienzyme. Deux types de complexes sont utilisés : peroxydase- antiperoxydase ou phosphatase alcaline- antiphosphatase alcaline (Figure 10).
 
Le laboratoire d’anatomie pathologique du centre François Baclesse utilise la méthode à la Streptavidine-peroxydase, présentée ci-dessous.
 
Après la microtomisation du tissu à étudier, le motif obtenu doit être étalé, à l’eau distillée, sur des lames spécifiques qui éviteront le décollement de la coupe lors du traitement par la chaleur. Le technicien dispose de plusieurs types de lames d’adhésion croissante :
- SuperFrost +âsont chargées électrostatiquement ce qui permet une meilleure adhérence de la coupe sur la lame ;
- Polylysineâ recouvertes de polylysine (une protéine qui permet la formation d’interactions ioniques entre la coupe et la lame) et chargées électrostatiquement ;
- SuperFrost +Goldâfabriquées à partir de verre adhésif.
 
Après étalement, les lames sont mises à l’étuve pendant une nuit à 56 °C (proche de la température de fusion de la paraffine), ce qui élimine le film liquidien compris entre la lame et la coupe paraffinée.
Selon le même principe que celui décrit auparavant, le déparaffinage est réalisé en trempant les lames dans 3 bains successifs de toluène puis d’alcool absolu vers des alcools de degré inférieur jusqu’à l’eau distillée (Annexe 8).
On effectue un blocage des peroxydases endogènes Afin d’éviter le bruit de fond, dû à la coloration de la peroxydase des hématies, on bloque l’activité peroxydasique du tissu étudié. Pour cela, les lames sont immergées dans une solution d’eau oxygénée (H2O2) à 3 %.
Un démasquage des sites antigéniques est rendu nécessaire par la fixation (Annexe 3), qui induit un changement de conformation des épitopes et donc une mauvaise reconnaissance de l’antigène par l’anticorps correspondant.
Le démasquage des sites antigéniques a été découvert au début des années 90 et a révolutionné l’immunohistochimie en augmentant considérablement le nombre d’anticorps utilisables sur coupes en paraffine.
Il peut se faire par un traitement enzymatique à la trypsine ; cependant le traitement par la chaleur au micro-onde est plus fréquent (quelquefois la cocotte-minute est utilisée pour des antigènes particuliers comme la cycline D1). Le démasquage des sites antigéniques se fait à une température voisine de 100°C pendant environ 15 minutes dans un tampon citrate. En effet ce dernier fixe le calcium qui interviendrait dans le renforcement des liaisons covalentes formées lors de la fixation (Figure 11).
 
Pour des prélèvements fixés avec des fixateurs au mercure, on élimine les agents mercuriels qui pourraient précipiter et engendrer une coloration parasite. Ce traitement se réalise en 2 étapes avec d’abord l’addition d’éthanol iodé à 3 % puis du thiosulfate de sodium.
Chaque lame est placée sur un Coverplateâ, dispositif qui permet de tenir les lames verticalement tout en laissant 100µl de solvant sur la lame (Annexe 9).
La biotine, vitamine contenue naturellement dans certains organes (comme le rein, les seins, la thyroïde, le foie ou les glandes surrénales), doit être inhibée pour éviter la fixation non spécifique du complexe streptavidine-peroxydase qui donne du bruit de fond.
Ce traitement s’effectue en 3 étapes. D’abord, de l’avidine (4 sites de fixation) est déposée dans chaque Coverplate (10 minutes d’incubation). Après rinçage, le technicien ajoute de la biotine exogène (ou libre qui ne possède qu’1 site de fixation), pour saturer les sites inoccupés de l’avidine (Figure 12A) afin qu’aucun anticorps biotinylé ne puisse s’y fixer ultérieurement.
 
L’incubation en sérum normal de chèvre au 1/5 évite le bruit de fond dû à une fixation non spécifique de l’anticorps secondaire. On sature tous les sites éventuels de fixation par un sérum non immun provenant de l’animal fournissant l’anticorps secondaire. L’incubation dure 15 minutes.
 
Sans rinçage et après la préparation plus tôt dans la journée des dilutions adéquates de chaque anticorps, le technicien répartit dans un premier temps les anticorps primaires sur les différentes lames et laisse incuber pendant 1 heure (Figure 12B). Dans un deuxième temps, il réalise une autre incubation avec l’anticorps biotinylé (ou secondaire) de 30 minutes. Dans un troisième temps, il apporte le complexe avidine-biotine peroxydase, qui va se fixer sur les anticorps biotinylés.
Entre chaque étape citée précédemment, on réalise un rinçage de 5 minutes dans du tampon PBS-Tween (Phosphate Buffer Saline) : un tampon phosphate contenant du NaCl et du Tween (agent mouillant).
La révélation est réalisée avec de la diaminobenzidine (ou DAB), un produit toxique, dont l’emploi nécessite des précautions particulières (travail sous hotte, port de gants et décontamination à l’eau de Javel). Son hydrolyse par la peroxydase en présence de H2O2 donne un précipité marron insoluble dans les solvants organiques. Les territoires (noyau, cytoplasme, membrane cytoplasmique) ayant fixé l’anticorps primaire sont donc repérables car ils apparaissent colorés en marron.
La Contre-coloration est réalisée à l’hématoxyline, un colorant nucléaire régressif, c’est-à-dire qui colore en excès. L’hématoxyline colore intensément les noyaux en violet mais aussi les cytoplasmes et le tissu de soutien (de façon beaucoup moins intense). Toutes les structures apparaissent et le repérage microscopique des zones intéressantes est facilité.
Cependant, dans le cas d’un immunomarquage nucléaire, on doit réaliser une différenciation à l’alcool acide qui décolore les cytoplasmes et le tissu conjonctif. On bleuit ensuite les noyaux à l’aide de carbonate de lithium. Un noyau bleu est donc considéré comme négatif et un noyau plus ou moins marron, comme positif (Figure 13).
Cette différenciation nucléaire sert à ne pas masquer un marquage faible par l’hématoxyline (trop intense ou mal différenciée) et facilite la quantification automatique par analyse d’images informatisée. La manipulation se termine par une déshydratation et un montage des lames.
 
Le technicien réalise ensuite une lecture de vérification de sa manipulation, puis une autre avec le médecin qui donne son diagnostic.
En parallèle des coupes témoins sont réalisées :
- témoins positifs servant à valider la manipulation. Un témoin positif est réalisé pour chaque anticorps utilisé.
- témoins négatifs pour éliminer les cas de faux positifs dûs à la fixation de l’anticorps secondaire. Pour effectuer ces tests, l’anticorps primaire est remplacé par du tampon. Ils sont réalisés pour chaque cas étudié.
 
L’utilisation d’un automate permet de diminuer la durée de la manipulation et surtout de libérer le technicien.
 
OPTIMISATION DE LA SENSIBILITE EN IHC ASPECTS PRATIQUES
TECHNIQUES IMMUNOHISTOCHIMIQUES STANDARD
Tampons de dilution
- des antisérums : ils autorisent une conservation prolongée des Ac dilués (1 5 jours à 4°C) : Tris-HCI pH 7,4 100 mM ; NACI 150 mM ; Albumine 1 % ; Tween 20 0,l % ; NaN3 0,l %
-de la streptavidine peroxydase
Le tampon est identique mais l'azide de sodium est remplacé par du thimérosal à 0,01 %. Les conjugués de streptavidine étant sensibles aux chocs thermiques, il est souhaitable, lors de leur manipulation hors du réfrigérateur, de les placer dans des blocs isothermes type Nalgene®. Les lots de streptavidine doivent être par ailleurs aliquotes et conservés à - 20 °C dès leur réception.
- Tampons de lavage
Les tampons Tris - HCI 50 mM pH 7,5 ou PBS 1X pH 7,4 (ce dernier est déconseillé pour les systèmes de révélation recourant aux phosphatages alcalines), sont additionnés de 0, 1 % de Tween 20.
- Blocage du bruit de fond
Ilest de moins en moins nécessaire de réaliser un tel blocage, du fait de l'utilisation croissante d'Ac monoclonaux et d'une meilleure purification des Ac polyclonaux. Le bruit de fond se traduit soit par un accrochage diffus, cellulaire et/ou intercellulaire, à caractère non granuleux, soit par un accrochage nucléaire en relation le plus souvent avec une surconcentration de l'Ac primaire.
Les différentes modalités de blocage du bruit de fond présentées ci-dessous sont classées par efficacité croissante :
Gélatine 0,l % à 1 %
Albumine bovine à 3 %
Sérum humain, 15 à 30 % (décomplémenté dans un bain marie pendant 1 heure à 56 °C)
Blotto (75 g lait en poudre écrémé Gloria ; 7,5 g de sérum albumine bovine (BSA) ; 0,75 ml de Tween 20 ; 250 ml de PBS ; 0, l % d'azide de sodium). Le blotto peut cependant engendrer des faux négatifs par adsorption de certains Ac.
Les coupes sont placées 20 minutes dans ces solutions, puis incubées avec l'Ac primaire, sans lavage intermédiaire.
Inhibition des activités enzymatiques endogènes
Peroxydases endogènes : la biotine est très résistante à l'eau oxygénée (H202), mais certains Ag y sont sensibles. Lorsque le montage utilisé ne fait pas appel à un Ac de liaison biotinylé, le blocage est traditionnellement effectué après le déparaffinage, par incubation pendant 30 minutes dans une solution de méthanol additionnée de 0,5 % d'H202. En revanche, si le montage recourt à un Ac de liaison biotinylé, le blocage doit être réalisé après ce dernier, par incubation des coupes pendant 10 minutes dans une solution 3 % H202 dans H20.
Phosphatases alcalines endogènes : le levamisole est l'inhibiteur de choix, mais présente l'inconvénient de ne pas bloquer les phosphatases alcalines intestinales. Son mécanisme d'action compétitif implique son incorporation dans le milieu de révélation. Une concentration de 0,24 mg/ml de milieu (0,5 mM) est en règle suffisante. Des concentrations trop élevées de levamisole peuvent entraîner une diminution de l'intensité du signal.
En hybridation in situ, il est possible de bloquer efficacement l'activité phosphatage alcaline ou phosphatage alcaline like en plongeant les coupes dans l'acide acétique à 20 % refroidi sur la glace, pendant 2 minutes, après le déparaffinage.
Blocage des biotines endogènes
Le blocage des biotines endogènes est en règle inutile sur coupes en paraffine, celles-ci étant inhibées, vraisemblablement par la chaleur, au cours des étapes d'inclusion en paraffine. Cependant, après démasquage antigénique, on retrouve les biotines endogènes dans certains tissus particulièrement riches (rein, thyroïde, surrénale, pancréas, foie,…) dans ces cas le blocage reste utile.
En revanche, ce blocage est indispensable sur coupes en congélation. Il est réalisé par incubations séquentielles avec une solution d'avidine, puis de biotine, à des concentrations optimisées pour lesquelles nous conseillons d'utiliser un kit de blocage.
Durée de l'incubation des Ac
En routine, la durée moyenne d'incubation de l'Ac primaire est de 30 minutes à 1 heure. L'incubation de l'Ac primaire sur la nuit permet à la réaction Ag- Ac d'atteindre son équilibre et par là même de diluer l'antisérum par un facteur trois et de diminuer un bruit de fond éventuel.
Révélation
L'intensité de l'immunomarquage peut être considérablement améliorée par addition au milieu de révélation d'une solution appelée MRX comportant des Agents mouillants et des détergents, éventuellement associée à du PVA (Polyvinyl alcool) ou à une intensification avec des sels métalliques.
A - Préparation du milieu de révélation
a) Peroxydase :
 Tris - HCI 50 mM pH 7,6 10 MI
 3 - 3'diaminobenzidine tetrahydrochloride dihydrate 6 mg
 MR 50X peroxydase 200 gl
 H202 30 % (1 10 Vol.) 3 gl
b) Phosphatase alcaline : pour 10 ml de solution, additionner dans l'ordre
-Fast Red TR (Sigma F 1500) : 10 mg
ou Fast blue BB salt (Sigma F 0250) : 30 mg à dissoudre dans 9,6 ml de Tris O, l M pH 8,2.
-  Naphtol AS - MX phosphate free acide (Sigma 4 875) : 200 itl (soit 2 mg) d'une solution stock à 10 mg/ml dans du DMF (Merck 2 937).
-Levamisole (Sigma L 9756) : 5 gl d'une solution stock 1 M.
-200 ml de MR 50X phosphatage
B - Préparation des solutions MR 50X (à conserver à 4'C)
a)MR 50X peroxydase :
 Brij 35 (solution 30 % Orgenics) 14,5 ml
 Saponine (Fluka 84 5 1 0) 500 mg
 Tween 20 (Sigma p 1379) : 2,5 ml
 H20 qsp : 50 ml
b)MR 50X phosphatage alcaline : obtenu par addition de 500 pl de MgCI2 IM sont additionnés à la solution précédente.
Sensibilisation par le PVA
Les solutions pour la révélation des peroxydases et des phosphatages alcalines, sont préparées comme précédemment (paragraphe 1.7 A) mais dans 2 ml de tampon Tris - HCI au lieu de 1 0 ml, et complétées à 10 ml avec 8 ml de Tris - HCI 50 mM pH 7,6 (peroxydase) ou 8 ml de Tris - HCI 50 mM pH 8,2 (phosphatage alcaline), contenant 10 % de PVA.
Les tampons Tris - HCI PVA 10 % sont obtenus par dissolution lente du PVA (30 000 - 70 000 Sigma P 181 316) dans les tampons Tris - HCI 50 mM pH 7,6 ou 8,2, en chauffant plusieurs heures avec agitation, à une température inférieure à 60 °C. A une température plus élevée, l'hydrolyse massive du polymère détermine une chute du pH.
Sensibilisation par un sel métallique (Nickel)
L'intensité du signal peut être amélioré par addition au milieu de révélation des peroxydases d'une solution à 0,2 % d'ammonium sulfate de Nickel (Ni [SO412 [NH4]2).
 
TECHNIQUES EN IMMUNOFLUORESCENCE
Le "fading" qui correspond à la décroissance progressive de la fluorescence est limité par l'utilisation d'un milieu de montage anti-fading. A côté des fluorochromes usuels (fluorescéine et rhodamine), des produits récemment commercialisés, dérivés des cyanines (Cy2, Cy3) ont l'avantage de présenter une très grande photostabilité et d'être moins sensibles au pH du milieu de montage.
Préparation du milieu de montage anti-fading
Dissoudre dans 90 ml de Tris-HCI 0,15 M pH 8,5, 12 g de PVA, sous agitation continue, à une température n'excédant pas 90 °C. Après dissolution, lorsque la température atteint 50 °C, ajouter 30 g de glycérol. Répartir le milieu dans des tubes et congeler à - 20 °C.
Polyvinyl alcool 40 000 (Sigma P1763)
Glycérol (Prolabo 24 387.292)
Milieu de Michel
Ce milieu autorise le transfert de biopsies provenant de correspondants n'ayant pas la possibilité de congeler leurs prélèvements. Il est opérationnel pour la détection des Ag extra-cellulaires, sous réserve du respect des conditions ci-dessous. Seuls les résultats positifs sont interprétables.
- Liquide de transport : 10ml de liquide de lavage, 5,5 gde sulfate d'ammonium
- Liquide de lavage pH 7
Acide citrique 25 mM
Di potassium hydrogéno phosphate 25 mM
Sulfate de magnésium 5 mM
N-Ethylmaléimide 5 mM
A la réception, rincer les échantillons trois fois pendant 30 mn dans le tampon de lavage, puis congeler les prélèvements pour réalisation immédiate ou différée de la technique.
Validité du milieu : 2 mois à 4 'C
Conservation des Ag jusqu'à 48 h dans ce milieu.
METHODE D'AMPLIFICATION UTILISANT LES DÉRIVES DE LA TYRAMINE
Cette méthode utilise la peroxydase pour catalyser le dépôt de conjugués de tyramine sur le site de la réaction immunologique. De nombreux essais ont été réalisés, utilisant plusieurs conjugés de la tyramine et faisant appel à des montages différents. La meilleure amplification est obtenue avec un conjugué tyramide - biotine, dans un montage utilisant un Ac biotinylé et une streptavidine peroxydase. Des kits sont commercialisés, mais il est possible de synthétiser à peu de frais les dérivés de la tyramine.
 Technique de préparation d'un conjugué de la tyramine
Tyramide - biotine :
- Préparer une solution 8,8 mM de NHS-LC biotine : dissoudre 20 mg dans 500 ml de NN' Diméthylformamide (DMF). Compléter à 5 ml avec un tampon Borate 50 mM pH 8,0
- Préparer une solution de 7,4 mM de Tyramine-HCI : dissoudre 6,4 mg dans 5 ml de tampon Borate 50 mM pH 8,0
- Additionner la solution de NHS - LC - biotine 8,8 mM (5 ml) à la solution de tyramine - HCI 7,4 mM (5ml) et soumettre le mélange à une agitation lente sur la nuit, à l'abri de la lumière.
- Aliquoter la solution de tyramide - biotine aqueuse ainsi obtenue et stocker à - 20 °C. Alternativement, la préparation peut être lyophilisée et resuspendue dans un volume équivalent d'éthanol à 85
Tyramide - digoxigénine :
-NHS-Digoxigenine : dissoudre 29 mg dans 500 ml de DMF.
-Compléter à 5 ml avec un tampon Borate 50 mM pH 8,0
-Procéder ensuite comme précédemment.
NN'diméthylformamide (Merck : 2937).
NHS - LC biotine (Pierce : 21336) Mr 455.
Tyramine - HCI (Sigma : T2879) Mr 173.6.
NHS - digoxigénine (Boehringer : 1 - 333054) Mr 658.8.
 
LES PETITS SECRETS DE LA PAILLASSE POUR UNE IHC REUSSIE
Les échecs et semi-succès des techniques immunohistochimiques ne sont pas tous liés à un démasquage antigénique imparfait ou à la sensibilité intrinsèque insuffisante des systèmes de détection. Ils peuvent être secondaires au décollement des coupes tissulaires, notamment lors du démasquage antigénique enzymatique ou thermique, ou au choix de paramètres pratiques de la réaction immunologique inadaptés. Enfin, l'intensité du signal final de la réaction immunoenzymatique est très dépendant de l'ajout ou non aux solutions d'incubations d'additifs agissant sur la mouillabilité des tissus, leur perméabilité ou sur la stabilité des solutés.
Adhérence aux lames de verre des coupes de tissus inclus en paraffine
Dans le cas le plus simple de l'étalement d'une coupe sur une lame de verre faisant appel à de l'eau distillée sont en présence :
1) le verre dont la surface, imparfaitement plane (notion de rugosité) est faiblement acide et porteuse de nombreux groupements hydroxyles (silanol) provenant de l'action, lors de la fabrication du verre, de la vapeur d'eau sur la silice en fusion. La surface du verre est recouverte d'une très fine pellicule aqueuse formée par fixation de molécules de vapeur d'eau aux groupements silanols de la surface du verre
2) la coupe, constituée d'une part de paraffine (un mélange formé principalement d'alcanes dont le degré de condensation est supérieur à 30) et d'autre part du tissu dont la composition est complexe et où alternent des plages polaires et apolaires, chargées positivement ou négativement, hydrophiles ou hydrophobes etc... Dans les conditions de l'étalement des coupes sur de l'eau distillée, la charge moyenne des tissus est négative. Tout ou partie de la superficie des coupes n'est pas incluse dans la paraffine comme en témoigne, par exemple, la possibilité de colorer ces derniers à l'aide de colorants en solution aqueuse, sans déparaffinage préalable (coloration de Giemsa selon le procédé de Schilling par exemple).
3) une goutte d'eau (si possible distillée et sans poussière).
Après étalement des coupes, élimination de l'excès d'eau et séchage des préparations microscopiques, une fine couche aqueuse persiste entre la coupe et la surface du verre qui n'est totalement déshydratée qu'à des températures supérieures à 400 °C.
Dans ces conditions, l'adhérence de la paraffine au verre se fait par l'intermédiaire de forces de van der Waals. Les interactions ioniques répulsives développées entre les charges négatives des tissus, d'une part et celles de la surface du verre d'autre part, régies par la classique loi de Coulomb, sont faibles du fait des distances séparant la coupe du verre d'une part (séparées qu'elles sont par la fine pellicule aqueuse) et par le fait que ces interactions s'exercent en milieu aqueux. Il est vraisemblable que les forces principales impliquées dans l'adhérence des coupes à la lame de verre sont : des interactions de Van der Waals et des liaisons hydrogènes développées entre des groupements donneurs ou accepteurs des tissus, les molécules d'eau résiduelles et les groupements silanols à la surface du verre.
Le séchage des préparations ne doit pas être effectué à la température du laboratoire. Dans ces conditions, en effet, l'évaporation de l'eau est lente et la paraffine reste dure, aussi ne s'applique-t-elle pas intimement au verre au fur et à mesure du départ de l'eau. De l'air vient alors s'interposer entre les molécules d'eau adsorbées à la surface du verre et la coupe. Celle-ci, n'adhèrent à la lame que par quelques points, a beaucoup de chance de se détacher ultérieurement. Il est donc nécessaire de sécher les coupes dans une étuve dont la température est réglée de telle sorte que la paraffine se ramollisse suffisamment pour devenir semi-transparente. Des décollements peuvent, en fait, survenir toutes les fois que la coupe n'est pas bien appliquée sur les rugosités du verre comme par exemple lorsque les coupes sont mal étalées ou que des poussières en suspension dans l'eau s'interposent entre la coupe et la lame. De même la rigidité naturelle des tissus (tumeurs épidermiques riches en kératine ou tissu osseux même décalcifié), ou induite par la fixation ou la décalcification peut constituer une gène importante à l'application des coupes sur les lames.
Différents procédés sont utilisés pour améliorer l'adhérence. En routine histologique, les coupes sont étalées sur des gouttes d'une solution albumineuse ou de gélatine (du collagène dénaturé). Ces protéines étant solubilisées dans des milieux dont le pH est supérieur à 6, sont fortement chargées négativement (leurs surfaces sont grossièrement porteuses de 100 fois plus de charges négatives que de charges positives). Par conséquent, ces molécules jouent leur rôle de colle non pas par l'intermédiaire d'interactions ioniques mais bien par celui de forces de van der Waals, et surtout par formation de liaisons hydrogènes entre d'une part les résidus N-H et carbonyles des liaisons peptidiques et certains groupements donneurs ou receveurs des résidus acides aminés ou hydrates de carbones, et d'autre part les groupements donneurs et receveurs des coupes et de l'eau adsorbée à la surface du verre et ceux des tissus.
Ces forces ne sont donc pas différentes de celles impliquées lors du montage des coupes sur une goutte d'eau. Dans ce dernier cas, les interactions ne peuvent se développer qu'aux points de contact entre les cellules et le verre. Lors de l'étalement des coupes à l'aide de colles protéiques, les solutions protéiques infiltrent les nombreux interstices laissés libres à la surface des coupes par la paraffine, entre les cellules et dans la matrice extracellulaire. Après séchage, les interactions électrostatiques peuvent donc se développer non seulement au niveau des points de contacts entre la cellule et le verre, mais également sur une surface plus ou moins grande des faces latérales des cellules et dans la matrice extracellulaire. La polylysine est une "protéine" particulière dont tous les résidus acides aminés sont porteurs à pH 7 d'un groupement NH3+. Des interactions ioniques peuvent donc ajouter leurs effets à ceux des interactions précitées. En pratique, l'adhérence des coupes montées à la polylysine est effectivement de bien meilleure qualité que celle des coupes montées à l'aide d'une solution albumineuse ou de collagène. Des décollements sont, cependant, encore observés après traitement thermique ou enzymatique des préparations histologiques.
Dans le domaine du collage des coupes, la silanisation des lames de verre a constitué un progrès technologique majeur. Les silanes réagissent aisément avec les surfaces siliceuses. En effet, en présence d'eau, les groupements alkoxy des silanes s'hydrolysent pour former des hydroxyles réagissant rapidement avec les groupements silanols à la surface du verre. La liaison de l'organosilane à la lame de verre est de type covalent. Si du g aminopropyl triethoxysilane est utilisé. la surface du verre est recouverte de groupements CH3 pouvant interagir avec les tissuspar l'intermédiaire d'interactions hydrophobes ou de van der Waals et de groupementNH3+. Ces.derniers peuvent être à l'origine d'interactions ioniques avec les tissus. Il est par ailleurs vraisemblable que des liaisons covalentes s'établissent entre le silane et les tissus par condensation des groupements amines du silane ive. les résidus carboxyles tissulaire. Si des décollements étaient encore observés après utilisation de coupes silanisées, ordinaires, on pourrait essayer d'améliorer l'adhérence en :
- augmentant la rugosité du verre par traitement bref de ce dernier à l'acide fluorhydrique (2),
- en augmentant le nombre des groupements silanols à la surface du verre par immersion des lames dans une solution d'acide sulfurique et de peroxyde d'hydrogène à chaud (solution Piranha),
- enfin en utilisant, pour monter les coupes, une solution diluée de glutaraldéhyde, un agent pontant, homobifonctionnel, réunissant par liaisons covalentes un NH2 du silane à un groupement tissulaire de même nature.
 
STRUCTURE DES COUPES HISTOLOGIQUES ET SITE DE LA REACTION IHC
Vu sous l'angle de l'accessibilité des sites antigéniques ou enzymatiques, la structure des tissus varie significativement d'un tissu à l'autre et avec la solution fixatrice utilisée. Les tissus épithéliaux sont formés de cellules cohésives et les différentes solutions ne peuvent se frayer un chemin entre les cellules qui les constituent qu'avec difficulté. A l'opposé, les cellules des tissus lymphoïdes, par exemple, sont séparées les unes des autres par de vastes espaces libres. Elles peuvent donc être abordées non seulement par leur face supérieure, la seule accessible pour la plupart des cellules épithéliales, mais également par leurs faces latérales. Ceci explique pourquoi les signaux des réactions IHC de mise en évidence des marqueurs membranaires des cellules lymphoïdes sont d'autant plus intenses que l'épaisseur des coupes est plus importante.
Au cours de la fixation, une partie du matériel cellulaire est extraite et cette extraction est variable d'un fixateur à l'autre, accrue par les méthodes de démasquage thermique ou enzymatique. Modérée avec le glutaraldéhyde, plus intense avec le formol à 4 %, elle devient considérable pour les tissus fixés au liquide de Bouin alcoolique. Cette extraction est responsable de la formation d'un système de micropores intracellulaires. Avec ce fixateur, les Ag non extraits sont donc relativement accessibles et le démasquage antigénique est moins utile que pour les tissus fixés au formol.
En IHC sur tissus inclus à la paraffine, tout comme en microscopie électronique lorsque la réaction est réalisée sur coupes ultrafines en "post embedding", la plus grande partie de la réaction immunohistochimique prend certainement place à la surface de la coupe. Le fait, qu'en cas de décollement focal, les signaux de la réaction immunologique soient plus intenses dans les territoires décollés que dans ceux adhérant à la lame de verre, en est une démonstration. Par ailleurs, si après incubation d'une coupe épaisse déparaffinée dans une solution d'Ac marqué à la peroxydase et révélation de l'activité enzymatique, la coupe est réincluse, coupée, montée sur lame, déparaffinée et recouverte d'une lamelle, le produit final de la réaction enzymatique apparaît comme un fin liseré coloré épousant les aspérités des deux faces de la coupe alors que l'intérieur même de celle-ci demeure incolore.
 
A PROPOS DE QUELQUES PARAMETRES DE LÀ REACTION IHC
Le pH des solutions d'incubation des Ac et des tampons de lavages
Le pH des solutions Ac et des tampons de lavage est un paramètre fondamental intervenant non seulement sur la détectabilité des Ag mais également sur la spécificité de la réaction IHC. Ce paramètre intervient vraisemblablement par l'intermédiaire de variations de la charge et de la conformation non seulement des épitopes, mais également des sites de liaisons des Ac. Mosmaan et al. ont, par exemple, montré qu'un Ac monoclonal dirigé contre l'Ag de groupe sanguin B2 du poulet, très spécifique à pH 6,5 et 7, croisait avec les Ag B14 et B15 à pH plus élevé. Idéalement, l'optimum du pH devrait donc être déterminé pour chaque Ac. Un pH de 7,4 convient, cependant, pour la plupart des applications.
Les deux tampons les plus utilisés sont le PBS (tampon phosphate 0,01 M, 0,15 M NACL, pH 7,4) ou le Tris-HCI salin (TBS) (Tris-HCI O,OIM à 0,05M ; 0,15 M NACI ; pH 7,4 à 7,6). Avec certains Ac monoclonaux, la réaction Ag-Ac se ferait moins bien en TBS qu'en PBS. Le PBS apportant une grande quantité de phosphate inorganique ne peut être utilisé avec les Ac marqués à la phosphatage alcaline (Principe de Le Châtelier). Un tel inconvénient n'est pas rencontré avec le tampon Tris qui bien au contraire favorise l'hydrolyse du substrat. Les fonctions alcool du Tris sont, en effet, transestérifiées par les phosphates libérés. Ceci explique peut être pourquoi l'activité phosphatage alcaline peut être efficacement mise en évidence par la technique au BCIP / NBT en utilisant un tampon Tris-HCI pH 9,4 alors qu'à ce pH le Tris n'exerce plus aucun effet tampon et que les phosphates libérés devraient faire rapidement chuter le pH du microenvironnement des sites de la réaction enzymatique.
Durée et température d'incubation
Au cours de la réaction immunohistochimique, les protéines Ac ou bloquant le bruit de fond et, en cas d'utilisation d'Ac marqués par une enzyme, les substrats de la réaction enzymatique doivent diffuser tout d'abord dans la solution d'incubation, puis à travers une fine couche aqueuse immobile qui recouvre les tissus, enfin à travers le système des micropores intracellulaires, avant de s'adsorber sur le substrat. Un chemin inverse est suivi par ces différents réactifs au cours des lavages. Ces phénomènes de diffusion sont certainement rapides puisque des rinçages de quelques dizaines de secondes à la pissette sont suffisants pour éliminer les Ac n'ayant pas réagi avec leur cible. Cette diffusion est d'autant plus rapide que les solutions sont plus concentrées, que leur température est plus élevée (augmentation du mouvement brownien, diminution des aggrégats moléculaires, dilatation des pores), enfin que les dimensions des réactifs sont plus réduites. Une réduction significative du volume (et donc de la masse) d'une molécule sphérique ne s'accompagne, cependant, que d'une diminution limitée de son diamètre. il n'est donc pas certain que l'emploi de fragments F(ab)2 s'accompagne d'un gain significatif de sensibilité des systèmes de détection, d'autant que l'avidité de ces fragments pour l'Ag est habituellement inférieure à celle des Ac correspondants, non modifiés.
Les antisérums contiennent fréquemment de 5 à10 Ac complémentaires d'un même épitope mais dont l'avidité est variable. Lorsque la solution d'incubation est déposée sur la coupe, les Ac situés les plus près des épitopes complémentaires réagissent les premiers et ceci quelle que soit leur affinité. Les interactions Ag-Ac sont en effet dynamiques et non statiques. Si des incubations prolongées sont pratiquées, les Ac de faible avidité sont progressivement remplacés par des Ac dont l'avidité est élevée. Il n'en va pas de même lors des incubations courtes et les Ac de faible affinité sont décrochés lors des lavages. C'est la raison pour laquelle les incubations prolongées (16 heures par exemple pour les Ac primaires, 1 à 2 heures ou plus, pour les secondaires) donnent, avec les Ac polyclonaux, les signaux les plus intenses avec le bruit de fond le plus faible. Vingt minutes sont nécessaires in vitro pour que l'interaction streptavidine biotine atteigne son maximum. Cette durée constitue donc la durée minimale d'incubation lors de l'utilisation de ce système sur coupe histologique. Les Ac monoclonaux sont des clones d'une même immunoglobuline. L'intensité du signal de la réaction immunohistochimique ne devrait donc pas varier significativement au cours du temps. L'expérience démontre qu'il n'en est pas toujours ainsi. Ce fait a tout d'abord été interprété comme témoignant d'un démasquage antigénique par inversion de la fixation formolée au cours des incubations prolongées. Ce mécanisme ne devrait plus intervenir après démasquage thermique. Une molécule d'IgG, du fait de sa bivalence, peut avoir une avidité 100 fois plus élevée qu'un simple fragment fab. Il est possible, compte tenu de la difficulté de l'accès des sites antigéniques dans les coupes histologiques, qu'un certain temps soit nécessaire pour que les deux valences interagissent avec les épitopes correspondants. Ces incubations prolongées ne sont indispensables que pour la détection d'Ag peu concentré. Il est habituel de pratiquer les incubations prolongées à 4°C pour limiter la prolifération bactérienne et les possibles activités protéasiques contaminantes d'une part, et diminuer l'évaporation du milieu de la réaction d'autre part. Cette évaporation peut être limitée en recouvrant le milieu d'incubation d'une fine couche d'huile de viscosité adéquate (à la condition que des surfactants soient présents dans le milieu d'incubation de façon à ce que ce dernier reste étalé sur la coupe et que la tension superficielle ne lui fasse pas prendre une forme sphérique). Dans notre expérience, les signaux obtenus lors d'incubations prolongées à 4°C sont clairement supérieurs à ceux observés lors d'incubation de même durée réalisés à 37°C sous fine couche d'huile. L'énergie d'association des Ac de faible affinité n'est vraisemblablement pas suffisamment forte, à cette température, pour résister à la dissociation.
La concentration des Ac et le phénomène de prozone
Par soucis d'économie, mais également de spécificité, et pour éviter le bruit de fond, la dilution des Ac doit être la plus importante possible sans pour autant sacrifier les signaux spécifiques les plus faibles. Il existe une forte corrélation entre la concentration utile des Ac, l'avidité de ces derniers et la concentration des Ag tissulaires accessibles, elle-même fonction des modalités de la fixation et du démasquage. Quand la concentration antigénique est élevée dans un territoire déterminé, les Ac peuvent être dilués de façon importante et, dans ces conditions, même des Ac de faible affinité peuvent donner des signaux dont l'intensité est utile. En revanche, si la concentration antigénique tissulaire locale est faible, des concentrations identiques d'Ac peuvent ne donner lieu à aucune coloration. La dilution de l'Ac devrait donc être adaptée, dans chaque cas, à la concentration antigénique (d'où l'intérêt très limité des Ac vendus en solution prédiluée).
Avec des concentrations élevées d'Ac primaire, les résultats des techniques immunologiques peuvent se réduire à un bruit de fond intense sans signaux spécifiques. Ces derniers peuvent apparaître après dilution de l'Ac primaire. Ce phénomène, dit de prozone, n'est observé qu'avec les méthodes immunohistochimiques indirectes et témoignerait d'un encombrement stérique, les Ac primaires tassés les uns sur les autres n'étant plus ou peu reconnus par les Ac secondaires. Il apparaît donc que l'efficience de la détection est toujours inférieure à 100 % dans les territoires à forte concentration antigénique et varie avec la densité des Ags. Ces points sont à prendre en considération lors des études quantitatives.
Les modalités du lavage des coupes
La réaction Ag-Ac est réversible et, dans la plupart des cas, l'affinité finale de l'Ac dépend très étroitement de la vitesse de dissociation des complexes. Il n'est donc pas étonnant que l'intensité, non seulement du bruit de fond mais également du signal spécifique, dépendent des modalités du lavage (durée, lavage par immersion ou par rinçage à la pissette, composition du tampon). Un lavage trop prolongé, avec un tampon pauvre en sel ou concentré en surfactants, diminue l'intensité de la coloration obtenue avec les Ac d'affinité moyenne ou faible. Il s'agit, là encore, d'une variable à prendre en compte lors des études quantitatives.
LES ADDITIFS
De nombreux produits chimiques peuvent être ajoutés au milieu d'incubation dans le but
 1) de diminuer le bruit de fond en entrant en compétition avec les Ac pour les sites de liaison tissulaire non spécifique (solutions protéiques ou surfactants)
 2) d'améliorer la mouillabilité de la surface de la coupe et donc la pénétration des Ac dans les interstices du système des micropores
3) de perméabiliser les membranes
4) d'améliorer la sensibilité des systèmes de détection immuno-histochimique
5) de stabiliser les Ac et les enzymes.
Ces additifs, pouvant interférer avec la réaction Ag-Ac, doivent être utilisés avec prudence. Ils peuvent en effet interférer avec la réaction Ag-Ac. Les effets d'un co-soluté peuvent s'opposer à ceux d'un autre et le bénéfice d'un mélange ne peut être apprécié que par la pratique. Compte-tenu de la dilution des Ac, les co-solutés présents dans les solutions commerciales d'Ac (sérum de veau fœtal pour les monoclonaux produits en culture, azide de sodium ou merthiolate, etc) n'interfèrent pas avec les résultats.
4.1. Les protéines inertes
Le lait écrémé, l'albumine bovine, le sérum de l'espèce fournissant le deuxième Ac, agissent par compétition pour les sites d'accrochage non spécifique. La composition du lait écrémé et du sérum est, bien entendu, bien plus complexe que celle des solutions albumineuses (qui, cependant, sont souvent loin d'être pures). Il est logique d'utiliser ces protéines en préincubations avant l'Ac primaire. L'albumine est également fréquemment ajoutée aux milieux d'incubation des Ac primaires ou secondaires comme stabilisant des Ac et pour limiter le bruit de fond. Il faut se méfier de la présence, dans ces solutions, de blocage d'une activité protéasique pouvant hydrolyser les Ac. Il convient par ailleurs de vérifier que les Ac secondaires et tertiaires ne croisent pas avec les Ac présents dans les sérums mais également, le cas échéant, dans le lait (le lait de vache contient outre des IgA, des IgG) ou les solutions albumineuses si ces dernières ne sont pas bien purifiées. Utilisées à des concentrations 10 à 100 fois plus élevées que celle des Ac, ces protéines sont majoritaires à l'interface tissu/solution d'incubation. Elles peuvent donc constituer une gène à la diffusion des Ac notamment en cas d'incubation courte.
4.2. Les détergents et surfactants
Des surfactants sont fréquemment ajoutés au milieu d'incubation des Ac et aux solutions de lavage. Ils interviendraient
1)en limitant le bruit de fond lié aux interactions hydrophobes développées entre les sites hydrophobes des Ac et ceux des tissus
2)en améliorant la mouillabilité de la coupe par réduction de sa tension de surface. Ils faciliteraient notamment la pénétration des milieux d'incubation dans le système des micropores
3)en stabilisant les Ac et les protéines enzymatiques et en limitant leur agrégation
4) enfin en perméabilisant les tissus.
Bien que les propriétés physico-chimiques de chaque surfactant soient relativement bien connues, le choix du (ou des) surfactant(s) le(s) mieux adapté(s) à la détection d'un Ag particulier dans un tissu donné reste largement empirique. Les surfactants porteurs de charges positives ou négatives ne sont habituellement pas utilisés car ils se fixent massivement sur les protéines qu'ils dénaturent. Les surfactants dits "doux", non chargés, comme les éthers d'alkylphényl polyoxyéthylène (Triton X100 et le composé fonctionnellement non distinct le Nonidet P-40) ou les esters d'acylpolyoxyéthylène sorbitan comme le Tween 20 ou zwittérioniques (comme le Chaps) sont habituellement préférés. Pour être effectifs, les détergents doivent être utilisés à des concentrations supérieures à une concentration dite concentration critique micellaire (CMC) (Tween 20 CMC : 6.0 mmol/1 ; Mr 1225 ; Triton X- 100 (CMC : 0,24 mmol/1 ; Mr 624,9 et Nonidet P-40 (CMC = 0,29mmol/1, Mr 602,8). Typiquement ces surfactants sont utilisés comme additifs à des concentrations de 0,l à 1 % (v/v) ce qui excède nettement leur CMC. La digitonine, la saponine ou la filipine (5) possèdent, elles aussi, des propriétés détergentes. Elles perméabilisent les membranes en formant avec le cholestérol des pores à travers les membranes (membrane plasmique, Golgi) tout en respectant les membranes pauvres en cholestérol comme celles limitant le réticulum endoplasmique et l'enveloppe nucléaire ou la membrane interne de mitochondries. Au plan pratique, il convient de noter que beaucoup de ces détergents sont des mélanges dont la composition peut varier d'un lot à l'autre, ce qui constitue une source potentielle de non reproductibilité. Il a, par exemple, été démontré jusqu'à 55 composés différents dans un lot de Triton X-100. De plus, beaucoup de ces détergents se dégradent naturellement au cours du temps avec formation de peroxydes et d'aldéhydes pouvant altérer les activités des protéines. Il est donc conseillé de les acheter par petites quantités et de ne pas les conserver trop longtemps. Enfin, il convient de garder à l'esprit qu'utilisés à trop fortes concentrations, ces détergents peuvent inhiber les réactions immuno-histochimiques en dénaturant ou solubilisant l'Ag recherché ou en dénaturant l'Ac.
4.3. Agents de stabilisation des Ac
Un facteur de perte de sensibilité, non négligeable, est la dénaturation ou l'hydrolyse des protéines Ac, notamment pendant les incubations prolongées. La stabilité des Ac peut être améliorée par l'ajout de protéines inertes (comme l'albumine) ou de surfactants dans le milieu d'incubation. Par ailleurs, depuis plus d'un demi-siècle, les biochimistes ont l'habitude de conserver les protéines ou les organites isolés dans du sucrose ou du glycérol concentré (environ 1 M). Nous avons testé l'ajout de concentrations variées de glycérol (5 à 30 %) dans les solutions Ac lors d'incubations prolongées. Pour une majorité d'Ac primaires, d'excellents résultats ont été obtenus à la concentration de 30 % (v/v). En revanche, ce trialcool semble inhiber l'interaction streptavidine biotine. Il vaut donc mieux le réserver aux milieux d'incubation des Ac primaires. Il convient par ailleurs de rappeler que le glycérol potentialise les effets perméabilisants (mais aussi solubilisants des protéines) des détergents. L'hydrolyse protéasique des Ac peut enfin être limitée par ajout dans le milieu d'incubation d'éthylmaléimide (un Agent alkylant interagissant principalement avec les groupements SH).
4.4. Les sels
Les lois de l'électrostatique nous apprennent que les macromolécules dont la charge nette est de même signe, se repoussent alors que celles de charge opposée tendent à s'associer. Ces interactions électrostatiques peuvent favoriser l'agrégation des protéines (Ac et protéines inertes) dans les solutions d'incubation et le développement d'un bruit de fond par développement d'interactions entre les Ac d'une part et les macromolécules chargées de la coupe d'autre part. De telles interactions peuvent être fortement modifiées par la présence d'ions de petite taille dans les solutions d'incubation. Ces ions constituent, en effet, autour des protéines, une atmosphère ionique de charge opposée formant écran. Plus la concentration des petits ions en solution (la force ionique) est élevée, plus efficient est l'effet écran électrostatique (théorie de Debye-Hückel) (Fig. 11). Les tampons PBS et TBS comportent habituellement du NACI à la concentration de 0,15 M. En cas de bruit de fond, la concentration saline peut être augmentée (0.5 M, la concentration en NACI de l'eau de mer). Il convient, cependant, de noter que ces ions en solution peuvent modifier l'avidité d'un Ac pour son Ag et diminuer ainsi le signal final de la réaction.
5 - LA MISE EN EVIDENCE DES ACTIVITES ENZYMATIQUES
Seuls quelques points seront ici discutés :
- Les enzymes conjugués aux Ac sont relativement instables. Par ailleurs, il est vraisemblable que leurs substrats en solution peuvent former des agrégats. Il apparaît donc logique d'ajouter au milieu d'incubation des surfactants qui, dans le même temps, améliorent la mouillabilité de la surface de la coupe pour la solution de révélation. L'expérience démontre que le gain de sensibilité peut être considérable avec des mélanges comportant du type Tween 20, Saponine et Brij 35 sont utilisés [6].
- Lors de la mise en évidence de l'activité peroxydasique, il est de bonne pratique
1) de limiter l'auto-oxydation de la DAB en réduisant au minimum l'exposition
de ce produit à la lumière et en utilisant des solutions tampons dégazées
2) d'être très attentif à la concentration du peroxyde d'hydrogène.
La gamme des concentrations d'H202 donnant lieu à une activité enzymatique maximale est étroite (Fig. 12). La concentration d'H202 des solutions commerciales est relativement stable, sauf en présence de métaux lourds et il est rare que des échecs de réactions immunohistochimqiues soient liés, sauf erreurs de manipulation, aux vieillissement de ces solutions. En revanche, les volumes utilisés étant souvent très faibles (quelques microlitres), les erreurs de pipetage sont fréquents (présence par exemple de gouttelettes résiduelles sur la face externe des cônes). Il est donc préférable d'utiliser des solutions diluées 6 % (v/v) par exemple au lieu de l'habituelle solution à 30 % (v/v)].
- Lors de la mise en évidence de l'activité de la phosphatage alcaline, il peut être intéressant d'ajouter dans le milieu un polymère inerte de type alcool polyvinylique, ce qui
1) stabilise les substrats de la réaction et permet ainsi des révélations prolongées
2) augmente l'intensité du signal
3) et limite le bruit de fond.
De bons résultats sont obtenus avec l'alcool polyvinylique de masse moléculaire relative moyenne de 40 000 (Sigma) à la concentration de 18 %. Il est important ici de souligner que la concentration des substrats de la réaction enzymatique dans les solutions d'alcool polyvinylique doit être nettement augmentée
 
Bulletin division française de l'AIP juin 1997, n° 25
 
FIXATION ET DEMASQUAGE UN COUPLE A OPTIMISER
 
Le démasquage thermique des Ag constitue une avancée considérable pour l'IHC sur coupes de tissus fixés. Les mécanismes de ce démasquage restent encore très mal compris. Par contre les paramètres qui régissent le procédé ont été largement étudiés et permettent d'optimiser de façon raisonnée, la technique de démasquage des Ag par la chaleur. De nombreux phénomènes ont été impliqués dans la fixation au formol, en particulier la formation de ponts entre acides aminés impliquant en particulier des résidus Tyrosine près du site de fixation ou une arginine située ailleurs (5). Certains épitopes ne sont pas affectés par la fixation au formol, d’autres ne le sont que lorsqu’ils sont associés à d’autres protéines non spécifiques
Immunofluorescence ou IHC sur coupes en congélation
La détection des Ag extracellulaires, telle qu'elle est réalisée en routine pour résoudre les problèmes de pathologie dermatologique et néphrologique ne nécessite pas, en règle, de fixation. L'utilisation d'une technique d'immunofluorescence directe ou indirecte assure une sensibilité optimale et une résolution topographique suffisante.
La détection d'un Ag porté par un type cellulaire au sein d'une population polymorphe de cellules, nécessite par contre une bonne morphologie pour identifier de façon fiable les cellules marquées. Plusieurs fixateurs sont couramment utilisés : l'acétone froid (4 °C) pendant 10 mn, suivi ou non d'une post fixation pendant 15 mn dans du chloroforme, le mélange paraformaldéhyde-périodate-lysine (5 mn), le mélange polyéthylène-glycol 600 (30 %) - alcool 96 (70 %)  : 15 mn, enfin le paraformaldéhyde 4 %. Dans notre expérience, le paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon PBS 1 X, pH 7,4 à 4 'C, pendant 2 mn 30 assure la meilleure morphologie. Il est opérationnel pour les Agde membrane et notamment leucocytaires, les récepteurs membranaires et nucléaires. La solution de paraformaldéhyde peut être aliquotée et congelée.
2 - IHC sur coupes en paraffine
Pour de nombreux Ac, les modalités de fixation des tissus ont un rôle critique sur l'efficience de la détection immunohistochimique des Ags. Or cette étape est peu maîtrisé (durée variable de fixation, stabilité relative dans le temps du fixateur).
Le formol à 30 % est obtenu par dissolution dans l'eau jusqu'à saturation de formaldéhyde gaz, et stabilisé par adjonction de 10 % de méthanol qui participera donc également à la fixation. En solution aqueuse, le formaldéhyde s'hydrate rapidement pour former du méthylène-glycol qui constitue le principal composant des solutions de formol. Cette réaction est réversible : au fur et à mesure que le formol se fixe au sein des tissus, de nouvelles molécules de formaldéhyde sont produites à partir du méthylène-glycol. Par ailleurs, le formol s'oxyde rapidement à l'air avec production d'acide formique d'où la nécessité de le tamponner. Ces quelques données soulignent donc la nécessité d'utiliser des solutions de paraformaldéhyde fraîchement préparéessi l'on souhaite, pour un travail défini, standardiser les conditions de fixation.
Le formol pénètre rapidement les tissus mais les fixe lentement. La pénétration tissulaire est favorisée par sa faible masse relative avec une constante de pénétration pratiquement identique pour les solutions de 8 à 30 %. Si la diffusion du formol dans les tissus est rapide, elle reste quand même conditionnée par l'épaisseur des fragments, comme le démontre la cinétique de fixation d'un cube de tissu hépatique de Icm dans une solution de formol à 10 % à température ambiante. La fixation est par contre un processus lent, qui s'effectue par l'établissement de liaisons covalentes inter et intra moléculaires avec les protéines, glycoprotéines, polysaccharides et acides nucléiques.
Un prélèvement fixé moins de 12 heures dans le formol, sera partiellement fixé par le méthanol stabilisant la solution et l'alcool ou l'acétone lors des étapes de déshydratation qui précèdent l'inclusion en paraffine. Rôle de la température sur la rapidité de la fixation qui explique l'efficacité des micro-ondes. Après quelques heures de fixation (4 à 5 heures) le formol diffuse dans toute l'épaisseur d'un fragment de petite taille. Le passage au micro-ondes accélère de façon considérable la cinétique de fixation par la chaleur générée.
En dépit de ces réserves, grâce aux techniques de démasquage par la chaleur, la plupart des fixateurs usuels sont compatibles avec une étude immunohistochimique : formol, AFA, B5, Bouin... Toutefois les fixateurs précipitants (liquide de Clark) ou fortement pontants (glutaraldéhyde) sont déconseillés au même titre qu'une fixation trop prolongée (au delà de 24 à 36 heures).
LES TECHNIQUES DE DEMASQUAGE DES ANTIGENES
Un nombre important d'Ag, notamment du fait des modifications conformationnelles de l'épitope liées à la fixation, ne sont pas reconnus par les Ac correspondants après inclusion en paraffine. Ces difficultés peuvent être contournées en prétraitant les coupes, avant l'application de l'Ac primaire, par une solution de protéase et/ou en les soumettant à un démasquage thermique.
- Prétraitement par une protéase :
Premier procédé proposé pour le démasquage des Ags, si son champ d'application s'est restreint avec le développement des techniques de démasquage thermique, il est encore indispensable pour un pool réduit de couples Ags-Ac.
L'efficacité des traitements protéasiques varie selon la structure de l'Ag considéré. Les protéases coupent en effet les protéines à des sites spécifiques, or en pratique, nous n'avons jamais connaissance de la séquence antigénique recherchée qui peut potentiellement comporter un site de coupure. Ceci explique en partie que pour un couple Ag-Ac défini, une protéase peut être plus efficace qu'une autre. La nature du fixateur et la durée de la fixation influencent considérablement la réponse au traitement protéasique avec pour corollaire une possibilité de digestion insuffisante ou de surdigestion. Il faut par ailleurs signaler que d'exceptionnelles modifications antigéniques, sources de non spécificité, ont été rapportées après traitement protéasique. Pour une activité optimale de l'enzyme, les conditions d'incubation des coupes dans la solution de protéase doivent être scrupuleusement respectées : en particulier le pH de la solution, la température de la réaction, et la concentration de l'enzyme qui devrait être exprimée en unité et non en mg pour obtenir une reproductibilité d'un lot à l'autre et d'un fournisseur à un autre. Dans les faits, la standardisation vraie d'un traitement protéasique s'avère impossible.
 Démasquage des Ag par la chaleur :
Il a révolutionné l'IHC en augmentant considérablement le nombre d'Ac utilisables sur coupes en paraffine. Le démasquage thermique est contrôlé par 4 paramètres : la température absolue à laquelle il est effectué, le pH de la solution de démasquage, la nature de la solution de démasquage, la durée du traitement.
 
Plus la température est élevée, plus le démasquage est rapide et efficace. L'autocuiseur présente en la matière un avantage déterminant par rapport au micro-ondes : la température qui y règne est de 118 °C (SEB Clipso®, soupape position 2), elle est homogène dans toute la solution, alors qu'elle est d'environ 100 °C et non homogène dans un micro-ondes (un cycle de 5 mn est nécessaire pour homogénéiser la température au sein d'un coplin contenant 40 ml de tampon citrate, placé au centre du micro-ondes).
b) le pH de la solution de démasquage
Pour la grande majorité des Ac l'intensité du marquage est peu influencée par le pH (de 1 à 10) de la solution. Pour certains Ac cependant, le pH est critique. C'est le cas pour l'Ac MIB-1 : dans une solution de tampon citrate (10 mM), de pH 3 à 5, aucun marquage n'est observé, mais à pH 6 l'immunomarquage devient optimal. C'est également le cas pour l'Ac HMB 45. Il apparaît donc que la quasi-totalité des Ac fonctionnels après démasquage thermique répondent à un prétraitement dans un tampon citrate à pH 6 ou plus élevé (mis à part d'exceptionnels Ac qui ne sont opérationnels qu'après démasquage à pH très acide). Au delà de pH 7,5, se produit une hydrolyse des tissus avec une dégradation marquée de la morphologie.
c) la nature de la solution de démasquage
De très nombreuses solutions ont été expérimentées et proposées. Quatre d'entre elles ont fait la preuve de leur efficacité : l'urée (10 mM), peu manipulable car s'accompagnant d'un dégagement d'ammoniaque lors de l'ébullition (qui nécessite de travailler sous une hotte), le chlorure d'aluminium (10 MM), mais surtout les chélateurs du calcium à la concentration de 10 mM : tampon citrate pH 6,0 et EDTA ou EGTA pH 8,0. Le tampon citrate et l'EDTA fournissent la plus grande sensibilité de marquage jointe à une grande reproductibilité. Ils sont par ailleurs simples à préparer. L’efficacité remarquable des chélateurs de calcium repose sur le fait présumé que le calcium, qui est l'ion métallique le plus abondant dans les tissus, intervient en stabilisant et en renforçant le pontage inter et intramoléculaire du formaldéhyde
Le démasquage thermique en présence d'un chélateur de calcium reposerait sur la rupture des liaisons covalentes établies par le formaldéhyde avec les macromolécules tissulaires grâce à l'énergie apportée par la température élevée et par le piégeage des ions calcium par le chélateur. Le rôle du calcium semble être démontré par le fait qu'un prétraitement avec une solution de citrate saturée par du chlorure de calcium, aboutit à une extinction du signal immunohistochimique
d) La durée du démasquage peut être standardisée en routine à 5 minutes avec un autocuiseur (118 °C) et à 3 fois 5 minutes (100 °C) avec un micro-ondes. Pour quelques Ag et notamment les Ag nucléaires, un gain de signal est obtenu avec un démasquage plus prolongé (15 mn en autocuiseur).
Le démasquage par la chaleur, dont le protocole est fourni en annexe, présente par ailleurs des avantages multiples : il est modérément influencé par la nature du fixateur et la durée de la fixation ; la morphologie est de très bonne qualité, avec toutefois des réserves pour certains tissus très riches en collagène ; il s'accompagne d'une diminution du bruit de fond pour certains Ac ; enfin, aucune induction de réaction croisée ou création de néo-Ag réactifs n'a été rapportée. Une standardisation est donc possible pour un pool important d'Ag à des fins d'analyse qualitative mais non quantitative. 75 à 80 % des Ag bénéficient d'un démasquage par la chaleur, 20 à 25 % n'en bénéficient pas, mais le traitement n'est délétère que pour un très faible pourcentage d'entre eux. En pratique, bien qu'il n'existe pas de combinaison optimale : température / solution d'incubation / pH pour tous les Ac, pour leur grande majorité ils sont opérationnels après un démasquage en autocuiseur pendant 5 mn dans un tampon citrate 0,01 M, pH 6,0 ou EDTA 0,01 M pH 8,0.
En conclusion le démasquage thermique a constitué une avancée considérable pour l'IHC sur coupes en paraffine, au même titre que l'utilisation des nouvelles techniques d'amplification (conjugués de tyramine). Ces progrès permettent de remettre en cause des profils immunohistochimiques que l'on croyait acquis (tels qu'une faible positivité pour la protéine S100 dans les neurosarcomes, qui ne relève le plus souvent que d’une faible sensibilité des moyens de détection couramment utilisés ) et participent à expliquer les différences portant sur la qualité du marquage immunohistochimique obtenu à partir d’un même matériel biopsique, d’un laboratoire à un autre.
 Protocole de démasquage des Ag par la chaleur en autocuiseur (SEB Clipso®)
- porter à ébullition le tampon de démasquage (citrate 10 mM, pH 6,0 ou EDTA 10 mM, pH 8,O), couvercle de l'autocuiseur non fermé.
-plonger les lames dans la solution (elles doivent être recouvertes d'un centimètre de tampon). Les lames sont disposées sur des racks métalliques et séparées les unes des autres par un espace de 4 mm pour éviter le piégeage de bulles d'air.
-fermer la cocotte, soupape en position 2.
- dès l'émission de vapeur, compter 5 mn et laisser partir la vapeur. - placer les lames sous l'eau courante pendant 2 à 3 mn (il est inutile, pour l'immense majorité des Ac, de laisser refroidir les lames 20 mn à la température de la pièce avant de déposer l'Ac primaire comme cela a été proposé par Shi, cet auteur ayant constaté que pour certains Ag le retour à leur conformation native nécessiterait un refroidissement progressif).
- transférer les lames dans un tampon Tris et appliquer l'Ac primaire.
N.B. :1 00 à 200 lames peuvent être traitées en 12 mn
le tampon peut être réutilisé pour 5 à 6 traitements en reconstituant le volume initial de la solution avec de l'eau distillée après chaque utilisation
 
 
OPTIMISATION DE LA SENSIBILITE EN IHC ASPECTS PRATIQUES
TECHNIQUES IMMUNOHISTOCHIMIQUES STANDARD
Tampons de dilution
- des antisérums : ils autorisent une conservation prolongée des Ac dilués (1 5 jours à 4°C) : Tris-HCI pH 7,4 100 mM ; NACI 150 mM ; Albumine 1 % ; Tween 20 0,l % ; NaN3 0,l %
-de la streptavidine peroxydase
Le tampon est identique mais l'azide de sodium est remplacé par du thimérosal à 0,01 %. Les conjugués de streptavidine étant sensibles aux chocs thermiques, il est souhaitable, lors de leur manipulation hors du réfrigérateur, de les placer dans des blocs isothermes type Nalgene®. Les lots de streptavidine doivent être par ailleurs aliquotes et conservés à - 20 °C dès leur réception.
- Tampons de lavage
Les tampons Tris - HCI 50 mM pH 7,5 ou PBS 1X pH 7,4 (ce dernier est déconseillé pour les systèmes de révélation recourant aux phosphatages alcalines), sont additionnés de 0, 1 % de Tween 20.
- Blocage du bruit de fond
Ilest de moins en moins nécessaire de réaliser un tel blocage, du fait de l'utilisation croissante d'Ac monoclonaux et d'une meilleure purification des Ac polyclonaux. Le bruit de fond se traduit soit par un accrochage diffus, cellulaire et/ou intercellulaire, à caractère non granuleux, soit par un accrochage nucléaire en relation le plus souvent avec une surconcentration de l'Ac primaire.
Les différentes modalités de blocage du bruit de fond présentées ci-dessous sont classées par efficacité croissante :
Gélatine 0,l % à 1 %
Albumine bovine à 3 %
Sérum humain, 15 à 30 % (décomplémenté dans un bain marie pendant 1 heure à 56 °C)
Blotto (75 g lait en poudre écrémé Gloria ; 7,5 g de sérum albumine bovine (BSA) ; 0,75 ml de Tween 20 ; 250 ml de PBS ; 0, l % d'azide de sodium). Le blotto peut cependant engendrer des faux négatifs par adsorption de certains Ac.
Les coupes sont placées 20 minutes dans ces solutions, puis incubées avec l'Ac primaire, sans lavage intermédiaire.
Inhibition des activités enzymatiques endogènes
Peroxydases endogènes : la biotine est très résistante à l'eau oxygénée (H202), mais certains Ag y sont sensibles. Lorsque le montage utilisé ne fait pas appel à un Ac de liaison biotinylé, le blocage est traditionnellement effectué après le déparaffinage, par incubation pendant 30 minutes dans une solution de méthanol additionnée de 0,5 % d'H202. En revanche, si le montage recourt à un Ac de liaison biotinylé, le blocage doit être réalisé après ce dernier, par incubation des coupes pendant 10 minutes dans une solution 3 % H202 dans H20.
Phosphatases alcalines endogènes : le levamisole est l'inhibiteur de choix, mais présente l'inconvénient de ne pas bloquer les phosphatases alcalines intestinales. Son mécanisme d'action compétitif implique son incorporation dans le milieu de révélation. Une concentration de 0,24 mg/ml de milieu (0,5 mM) est en règle suffisante. Des concentrations trop élevées de levamisole peuvent entraîner une diminution de l'intensité du signal.
En hybridation in situ, il est possible de bloquer efficacement l'activité phosphatage alcaline ou phosphatage alcaline like en plongeant les coupes dans l'acide acétique à 20 % refroidi sur la glace, pendant 2 minutes, après le déparaffinage.
Blocage des biotines endogènes
Le blocage des biotines endogènes est en règle inutile sur coupes en paraffine, celles-ci étant inhibées, vraisemblablement par la chaleur, au cours des étapes d'inclusion en paraffine. Cependant, après démasquage antigénique, on retrouve les biotines endogènes dans certains tissus particulièrement riches (rein, thyroïde, surrénale, pancréas, foie,…) dans ces cas le blocage reste utile.
En revanche, ce blocage est indispensable sur coupes en congélation. Il est réalisé par incubations séquentielles avec une solution d'avidine, puis de biotine, à des concentrations optimisées pour lesquelles nous conseillons d'utiliser un kit de blocage.
Durée de l'incubation des Ac
En routine, la durée moyenne d'incubation de l'Ac primaire est de 30 minutes à 1 heure. L'incubation de l'Ac primaire sur la nuit permet à la réaction Ag - Ac d'atteindre son équilibre et par là même de diluer l'antisérum par un facteur trois et de diminuer un bruit de fond éventuel.
Révélation
L'intensité de l'immunomarquage peut être considérablement améliorée par addition au milieu de révélation d'une solution appelée MRX comportant des agents mouillants et des détergents, éventuellement associée à du PVA (Polyvinyl alcool) ou à une intensification avec des sels métalliques.
A - Préparation du milieu de révélation
a) Peroxydase :
 Tris - HCI 50 mM pH 7,6 10 MI
 3 - 3'diaminobenzidine tetrahydrochloride dihydrate 6 mg
 MR 50X peroxydase 200 gl
 H202 30 % (1 10 Vol.) 3 gl
b) Phosphatase alcaline : pour 10 ml de solution, additionner dans l'ordre
-Fast Red TR (Sigma F 1500) : 10 mg
ou Fast blue BB salt (Sigma F 0250) : 30 mg à dissoudre dans 9,6 ml de Tris O, l M pH 8,2.
-  Naphtol AS - MX phosphate free acide (Sigma 4 875) : 200 itl (soit 2 mg) d'une solution stock à 10 mg/ml dans du DMF (Merck 2 937).
-Levamisole (Sigma L 9756) : 5 gl d'une solution stock 1 M.
-200 ml de MR 50X phosphatage
B - Préparation des solutions MR 50X (à conserver à 4'C)
a)MR 50X peroxydase :
 Brij 35 (solution 30 % Orgenics) 14,5 ml
 Saponine (Fluka 84 5 1 0) 500 mg
 Tween 20 (Sigma p 1379) : 2,5 ml
 H20 qsp : 50 ml
b)MR 50X phosphatage alcaline : obtenu par addition de 500 pl de MgCI2 IM sont additionnés à la solution précédente.
Sensibilisation par le PVA
Les solutions pour la révélation des peroxydases et des phosphatages alcalines, sont préparées comme précédemment (paragraphe 1.7 A) mais dans 2 ml de tampon Tris - HCI au lieu de 1 0 ml, et complétées à 10 ml avec 8 ml de Tris - HCI 50 mM pH 7,6 (peroxydase) ou 8 ml de Tris - HCI 50 mM pH 8,2 (phosphatage alcaline), contenant 10 % de PVA.
Les tampons Tris - HCI PVA 10 % sont obtenus par dissolution lente du PVA (30 000 - 70 000 Sigma P 181 316) dans les tampons Tris - HCI 50 mM pH 7,6 ou 8,2, en chauffant plusieurs heures avec agitation, à une température inférieure à 60 °C. A une température plus élevée, l'hydrolyse massive du polymère détermine une chute du pH.
Sensibilisation par un sel métallique (Nickel)
L'intensité du signal peut être amélioré par addition au milieu de révélation des peroxydases d'une solution à 0,2 % d'ammonium sulfate de Nickel (Ni [SO412 [NH4]2).
 
TECHNIQUES EN IMMUNOFLUORESCENCE
Le "fading" qui correspond à la décroissance progressive de la fluorescence est limité par l'utilisation d'un milieu de montage anti-fading. A côté des fluorochromes usuels (fluorescéine et rhodamine), des produits récemment commercialisés, dérivés des cyanines (Cy2, Cy3) ont l'avantage de présenter une très grande photostabilité et d'être moins sensibles au pH du milieu de montage.
Préparation du milieu de montage anti-fading
Dissoudre dans 90 ml de Tris-HCI 0,15 M pH 8,5, 12 g de PVA, sous agitation continue, à une température n'excédant pas 90 °C. Après dissolution, lorsque la température atteint 50 °C, ajouter 30 g de glycérol. Répartir le milieu dans des tubes et congeler à - 20 °C.
Polyvinyl alcool 40 000 (Sigma P1763)
Glycérol (Prolabo 24 387.292)
Milieu de Michel
Ce milieu autorise le transfert de biopsies provenant de correspondants n'ayant pas la possibilité de congeler leurs prélèvements. Il est opérationnel pour la détection des Agextra-cellulaires, sous réserve du respect des conditions ci-dessous. Seuls les résultats positifs sont interprétables.
- Liquide de transport : 10ml de liquide de lavage, 5,5 gde sulfate d'ammonium
- Liquide de lavage pH 7
Acide citrique 25 mM
Di potassium hydrogéno phosphate 25 mM
Sulfate de magnésium 5 mM
N-Ethylmaléimide 5 mM
A la réception, rincer les échantillons trois fois pendant 30 mn dans le tampon de lavage, puis congeler les prélèvements pour réalisation immédiate ou différée de la technique.
Validité du milieu : 2 mois à 4 'C
Conservation des Agjusqu'à 48 h dans ce milieu.
METHODE D'AMPLIFICATION UTILISANT LES DÉRIVES DE LA TYRAMINE
Cette méthode utilise la peroxydase pour catalyser le dépôt de conjugués de tyramine sur le site de la réaction immunologique. De nombreux essais ont été réalisés, utilisant plusieurs conjugés de la tyramine et faisant appel à des montages différents. La meilleure amplification est obtenue avec un conjugué tyramide - biotine, dans un montage utilisant un Ac biotinylé et une streptavidine peroxydase. Des kits sont commercialisés, mais il est possible de synthétiser à peu de frais les dérivés de la tyramine.
 Technique de préparation d'un conjugué de la tyramine
Tyramide - biotine :
- Préparer une solution 8,8 mM de NHS-LC biotine : dissoudre 20 mg dans 500 ml de NN' Diméthylformamide (DMF). Compléter à 5 ml avec un tampon Borate 50 mM pH 8,0
- Préparer une solution de 7,4 mM de Tyramine-HCI : dissoudre 6,4 mg dans 5 ml de tampon Borate 50 mM pH 8,0
- Additionner la solution de NHS - LC - biotine 8,8 mM (5 ml) à la solution de tyramine - HCI 7,4 mM (5ml) et soumettre le mélange à une agitation lente sur la nuit, à l'abri de la lumière.
- Aliquoter la solution de tyramide - biotine aqueuse ainsi obtenue et stocker à - 20 °C. Alternativement, la préparation peut être lyophilisée et resuspendue dans un volume équivalent d'éthanol à 85
Tyramide - digoxigénine :
-NHS-Digoxigenine : dissoudre 29 mg dans 500 ml de DMF.
-Compléter à 5 ml avec un tampon Borate 50 mM pH 8,0
-Procéder ensuite comme précédemment.
NN'diméthylformamide (Merck : 2937).
NHS - LC biotine (Pierce : 21336) Mr 455.
Tyramine - HCI (Sigma : T2879) Mr 173.6.
NHS - digoxigénine (Boehringer : 1 - 333054) Mr 658.8.
 
LES PETITS SECRETS DE LA PAILLASSE POUR UNE IHC REUSSIE
Les échecs et semi-succès des techniques immunohistochimiques ne sont pas tous liés à un démasquage antigénique imparfait ou à la sensibilité intrinsèque insuffisante des systèmes de détection. Ils peuvent être secondaires au décollement des coupes tissulaires, notamment lors du démasquage antigénique enzymatique ou thermique, ou au choix de paramètres pratiques de la réaction immunologique inadaptés. Enfin, l'intensité du signal final de la réaction immunoenzymatique est très dépendant de l'ajout ou non aux solutions d'incubations d'additifs agissant sur la mouillabilité des tissus, leur perméabilité ou sur la stabilité des solutés.
Adhérence aux lames de verre des coupes de tissus inclus en paraffine
Dans le cas le plus simple de l'étalement d'une coupe sur une lame de verre faisant appel à de l'eau distillée sont en présence :
1) le verre dont la surface, imparfaitement plane (notion de rugosité) est faiblement acide et porteuse de nombreux groupements hydroxyles (silanol) provenant de l'action, lors de la fabrication du verre, de la vapeur d'eau sur la silice en fusion. La surface du verre est recouverte d'une très fine pellicule aqueuse formée par fixation de molécules de vapeur d'eau aux groupements silanols de la surface du verre
2) la coupe, constituée d'une part de paraffine (un mélange formé principalement d'alcanes dont le degré de condensation est supérieur à 30) et d'autre part du tissu dont la composition est complexe et où alternent des plages polaires et apolaires, chargées positivement ou négativement, hydrophiles ou hydrophobes etc... Dans les conditions de l'étalement des coupes sur de l'eau distillée, la charge moyenne des tissus est négative. Tout ou partie de la superficie des coupes n'est pas incluse dans la paraffine comme en témoigne, par exemple, la possibilité de colorer ces derniers à l'aide de colorants en solution aqueuse, sans déparaffinage préalable (coloration de Giemsa selon le procédé de Schilling par exemple).
3) une goutte d'eau (si possible distillée et sans poussière).
Après étalement des coupes, élimination de l'excès d'eau et séchage des préparations microscopiques, une fine couche aqueuse persiste entre la coupe et la surface du verre qui n'est totalement déshydratée qu'à des températures supérieures à 400 °C.
Dans ces conditions, l'adhérence de la paraffine au verre se fait par l'intermédiaire de forces de van der Waals. Les interactions ioniques répulsives développées entre les charges négatives des tissus, d'une part et celles de la surface du verre d'autre part, régies par la classique loi de Coulomb, sont faibles du fait des distances séparant la coupe du verre d'une part (séparées qu'elles sont par la fine pellicule aqueuse) et par le fait que ces interactions s'exercent en milieu aqueux. Il est vraisemblable que les forces principales impliquées dans l'adhérence des coupes à la lame de verre sont : des interactions de Van der Waals et des liaisons hydrogènes développées entre des groupements donneurs ou accepteurs des tissus, les molécules d'eau résiduelles et les groupements silanols à la surface du verre.
Le séchage des préparations ne doit pas être effectué à la température du laboratoire. Dans ces conditions, en effet, l'évaporation de l'eau est lente et la paraffine reste dure, aussi ne s'applique-t-elle pas intimement au verre au fur et à mesure du départ de l'eau. De l'air vient alors s'interposer entre les molécules d'eau adsorbées à la surface du verre et la coupe. Celle-ci, n'adhèrent à la lame que par quelques points, a beaucoup de chance de se détacher ultérieurement. Il est donc nécessaire de sécher les coupes dans une étuve dont la température est réglée de telle sorte que la paraffine se ramollisse suffisamment pour devenir semi-transparente. Des décollements peuvent, en fait, survenir toutes les fois que la coupe n'est pas bien appliquée sur les rugosités du verre comme par exemple lorsque les coupes sont mal étalées ou que des poussières en suspension dans l'eau s'interposent entre la coupe et la lame. De même la rigidité naturelle des tissus (tumeurs épidermiques riches en kératine ou tissu osseux même décalcifié), ou induite par la fixation ou la décalcification peut constituer une gène importante à l'application des coupes sur les lames.
Différents procédés sont utilisés pour améliorer l'adhérence. En routine histologique, les coupes sont étalées sur des gouttes d'une solution albumineuse ou de gélatine (du collagène dénaturé). Ces protéines étant solubilisées dans des milieux dont le pH est supérieur à 6, sont fortement chargées négativement (leurs surfaces sont grossièrement porteuses de 100 fois plus de charges négatives que de charges positives). Par conséquent, ces molécules jouent leur rôle de colle non pas par l'intermédiaire d'interactions ioniques mais bien par celui de forces de van der Waals, et surtout par formation de liaisons hydrogènes entre d'une part les résidus N-H et carbonyles des liaisons peptidiques et certains groupements donneurs ou receveurs des résidus acides aminés ou hydrates de carbones, et d'autre part les groupements donneurs et receveurs des coupes et de l'eau adsorbée à la surface du verre et ceux des tissus.
Ces forces ne sont donc pas différentes de celles impliquées lors du montage des coupes sur une goutte d'eau. Dans ce dernier cas, les interactions ne peuvent se développer qu'aux points de contact entre les cellules et le verre. Lors de l'étalement des coupes à l'aide de colles protéiques, les solutions protéiques infiltrent les nombreux interstices laissés libres à la surface des coupes par la paraffine, entre les cellules et dans la matrice extracellulaire. Après séchage, les interactions électrostatiques peuvent donc se développer non seulement au niveau des points de contacts entre la cellule et le verre, mais également sur une surface plus ou moins grande des faces latérales des cellules et dans la matrice extracellulaire. La polylysine est une "protéine" particulière dont tous les résidus acides aminés sont porteurs à pH 7 d'un groupement NH3+. Des interactions ioniques peuvent donc ajouter leurs effets à ceux des interactions précitées. En pratique, l'adhérence des coupes montées à la polylysine est effectivement de bien meilleure qualité que celle des coupes montées à l'aide d'une solution albumineuse ou de collagène. Des décollements sont, cependant, encore observés après traitement thermique ou enzymatique des préparations histologiques.
Dans le domaine du collage des coupes, la silanisation des lames de verre a constitué un progrès technologique majeur. Les silanes réagissent aisément avec les surfaces siliceuses. En effet, en présence d'eau, les groupements alkoxy des silanes s'hydrolysent pour former des hydroxyles réagissant rapidement avec les groupements silanols à la surface du verre. La liaison de l'organosilane à la lame de verre est de type covalent. Si du g aminopropyl triethoxysilane est utilisé. la surface du verre est recouverte de groupements CH3 pouvant interagir avec les tissuspar l'intermédiaire d'interactions hydrophobes ou de van der Waals et de groupementNH3+. Ces.derniers peuvent être à l'origine d'interactions ioniques avec les tissus. Il est par ailleurs vraisemblable que des liaisons covalentes s'établissent entre le silane et les tissus par condensation des groupements amines du silane ive. les résidus carboxyles tissulaire. Si des décollements étaient encore observés après utilisation de coupes silanisées, ordinaires, on pourrait essayer d'améliorer l'adhérence en :
- augmentant la rugosité du verre par traitement bref de ce dernier à l'acide fluorhydrique (2),
- en augmentant le nombre des groupements silanols à la surface du verre par immersion des lames dans une solution d'acide sulfurique et de peroxyde d'hydrogène à chaud (solution Piranha),
- enfin en utilisant, pour monter les coupes, une solution diluée de glutaraldéhyde, un agent pontant, homobifonctionnel, réunissant par liaisons covalentes un NH2 du silane à un groupement tissulaire de même nature.
 
STRUCTURE DES COUPES HISTOLOGIQUES ET SITE DE LA REACTION IHC
Vu sous l'angle de l'accessibilité des sites antigéniques ou enzymatiques, la structure des tissus varie significativement d'un tissu à l'autre et avec la solution fixatrice utilisée. Les tissus épithéliaux sont formés de cellules cohésives et les différentes solutions ne peuvent se frayer un chemin entre les cellules qui les constituent qu'avec difficulté. A l'opposé, les cellules des tissus lymphoïdes, par exemple, sont séparées les unes des autres par de vastes espaces libres. Elles peuvent donc être abordées non seulement par leur face supérieure, la seule accessible pour la plupart des cellules épithéliales, mais également par leurs faces latérales. Ceci explique pourquoi les signaux des réactions IHC de mise en évidence des marqueurs membranaires des cellules lymphoïdes sont d'autant plus intenses que l'épaisseur des coupes est plus importante.
Au cours de la fixation, une partie du matériel cellulaire est extraite et cette extraction est variable d'un fixateur à l'autre, accrue par les méthodes de démasquage thermique ou enzymatique. Modérée avec le glutaraldéhyde, plus intense avec le formol à 4 %, elle devient considérable pour les tissus fixés au liquide de Bouin alcoolique. Cette extraction est responsable de la formation d'un système de micropores intracellulaires. Avec ce fixateur, les Agnon extraits sont donc relativement accessibles et le démasquage antigénique est moins utile que pour les tissus fixés au formol.
En IHC sur tissus inclus à la paraffine, tout comme en microscopie électronique lorsque la réaction est réalisée sur coupes ultrafines en "post embedding", la plus grande partie de la réaction immunohistochimique prend certainement place à la surface de la coupe. Le fait, qu'en cas de décollement focal, les signaux de la réaction immunologique soient plus intenses dans les territoires décollés que dans ceux adhérant à la lame de verre, en est une démonstration. Par ailleurs, si après incubation d'une coupe épaisse déparaffinée dans une solution d'Ac marqué à la peroxydase et révélation de l'activité enzymatique, la coupe est réincluse, coupée, montée sur lame, déparaffinée et recouverte d'une lamelle, le produit final de la réaction enzymatique apparaît comme un fin liseré coloré épousant les aspérités des deux faces de la coupe alors que l'intérieur même de celle-ci demeure incolore.
 
A PROPOS DE QUELQUES PARAMETRES DE LÀ REACTION IHC
Le pH des solutions d'incubation des Ac et des tampons de lavages
Le pH des solutions Ac et des tampons de lavage est un paramètre fondamental intervenant non seulement sur la détectabilité des Ag mais également sur la spécificité de la réaction IHC. Ce paramètre intervient vraisemblablement par l'intermédiaire de variations de la charge et de la conformation non seulement des épitopes, mais également des sites de liaisons des Ac. Mosmaan et al. ont, par exemple, montré qu'un Ac monoclonal dirigé contre l'Ag de groupe sanguin B2 du poulet, très spécifique à pH 6,5 et 7, croisait avec les AgB14 et B15 à pH plus élevé. Idéalement, l'optimum du pH devrait donc être déterminé pour chaque Ac. Un pH de 7,4 convient, cependant, pour la plupart des applications.
Les deux tampons les plus utilisés sont le PBS (tampon phosphate 0,01 M, 0,15 M NACL, pH 7,4) ou le Tris-HCI salin (TBS) (Tris-HCI O,OIM à 0,05M ; 0,15 M NACI ; pH 7,4 à 7,6). Avec certains Ac monoclonaux, la réaction Ag Ac se ferait moins bien en TBS qu'en PBS. Le PBS apportant une grande quantité de phosphate inorganique ne peut être utilisé avec les Ac marqués à la phosphatage alcaline (Principe de Le Châtelier). Un tel inconvénient n'est pas rencontré avec le tampon Tris qui bien au contraire favorise l'hydrolyse du substrat. Les fonctions alcool du Tris sont, en effet, transestérifiées par les phosphates libérés. Ceci explique peut être pourquoi l'activité phosphatage alcaline peut être efficacement mise en évidence par la technique au BCIP / NBT en utilisant un tampon Tris-HCI pH 9,4 alors qu'à ce pH le Tris n'exerce plus aucun effet tampon et que les phosphates libérés devraient faire rapidement chuter le pH du microenvironnement des sites de la réaction enzymatique.
Durée et température d'incubation
Au cours de la réaction immunohistochimique, les protéines Ac ou bloquant le bruit de fond et, en cas d'utilisation d'Ac marqués par une enzyme, les substrats de la réaction enzymatique doivent diffuser tout d'abord dans la solution d'incubation, puis à travers une fine couche aqueuse immobile qui recouvre les tissus, enfin à travers le système des micropores intracellulaires, avant de s'adsorber sur le substrat. Un chemin inverse est suivi par ces différents réactifs au cours des lavages. Ces phénomènes de diffusion sont certainement rapides puisque des rinçages de quelques dizaines de secondes à la pissette sont suffisants pour éliminer les Ac n'ayant pas réagi avec leur cible. Cette diffusion est d'autant plus rapide que les solutions sont plus concentrées, que leur température est plus élevée (augmentation du mouvement brownien, diminution des agrégats moléculaires, dilatation des pores), enfin que les dimensions des réactifs sont plus réduites. Une réduction significative du volume (et donc de la masse) d'une molécule sphérique ne s'accompagne, cependant, que d'une diminution limitée de son diamètre. il n'est donc pas certain que l'emploi de fragments F(ab)2 s'accompagne d'un gain significatif de sensibilité des systèmes de détection, d'autant que l'avidité de ces fragments pour l'Ag est habituellement inférieure à celle des Ac correspondants, non modifiés.
Les antisérums contiennent fréquemment de 5 à10 Ac complémentaires d'un même épitope mais dont l'avidité est variable. Lorsque la solution d'incubation est déposée sur la coupe, les Ac situés les plus près des épitopes complémentaires réagissent les premiers et ceci quelle que soit leur affinité. Les interactions Ag-Ac sont en effet dynamiques et non statiques. Si des incubations prolongées sont pratiquées, les Ac de faible avidité sont progressivement remplacés par des Ac dont l'avidité est élevée. Il n'en va pas de même lors des incubations courtes et les Ac de faible affinité sont décrochés lors des lavages. C'est la raison pour laquelle les incubations prolongées (16 heures par exemple pour les Ac primaires, 1 à 2 heures ou plus, pour les secondaires) donnent, avec les Ac polyclonaux, les signaux les plus intenses avec le bruit de fond le plus faible. Vingt minutes sont nécessaires in vitro pour que l'interaction streptavidine biotine atteigne son maximum. Cette durée constitue donc la durée minimale d'incubation lors de l'utilisation de ce système sur coupe histologique. Les Ac monoclonaux sont des clones d'une même immunoglobuline. L'intensité du signal de la réaction immunohistochimique ne devrait donc pas varier significativement au cours du temps. L'expérience démontre qu'il n'en est pas toujours ainsi. Ce fait a tout d'abord été interprété comme témoignant d'un démasquage antigénique par inversion de la fixation formolée au cours des incubations prolongées. Ce mécanisme ne devrait plus intervenir après démasquage thermique. Une molécule d'IgG, du fait de sa bivalence, peut avoir une avidité 100 fois plus élevée qu'un simple fragment fab. Il est possible, compte tenu de la difficulté de l'accès des sites antigéniques dans les coupes histologiques, qu'un certain temps soit nécessaire pour que les deux valences interagissent avec les épitopes correspondants. Ces incubations prolongées ne sont indispensables que pour la détection d'Ag peu concentré. Il est habituel de pratiquer les incubations prolongées à 4°C pour limiter la prolifération bactérienne et les possibles activités protéasiques contaminantes d'une part, et diminuer l'évaporation du milieu de la réaction d'autre part. Cette évaporation peut être limitée en recouvrant le milieu d'incubation d'une fine couche d'huile de viscosité adéquate (à la condition que des surfactants soient présents dans le milieu d'incubation de façon à ce que ce dernier reste étalé sur la coupe et que la tension superficielle ne lui fasse pas prendre une forme sphérique). Dans notre expérience, les signaux obtenus lors d'incubations prolongées à 4°C sont clairement supérieurs à ceux observés lors d'incubation de même durée réalisés à 37°C sous fine couche d'huile. L'énergie d'association des Ac de faible affinité n'est vraisemblablement pas suffisamment forte, à cette température, pour résister à la dissociation.
La concentration des Ac et le phénomène de prozone
Par soucis d'économie, mais également de spécificité, et pour éviter le bruit de fond, la dilution des Ac doit être la plus importante possible sans pour autant sacrifier les signaux spécifiques les plus faibles. Il existe une forte corrélation entre la concentration utile des Ac, l'avidité de ces derniers et la concentration des Agtissulaires accessibles, elle-même fonction des modalités de la fixation et du démasquage. Quand la concentration antigénique est élevée dans un territoire déterminé, les Ac peuvent être dilués de façon importante et, dans ces conditions, même des Ac de faible affinité peuvent donner des signaux dont l'intensité est utile. En revanche, si la concentration antigénique tissulaire locale est faible, des concentrations identiques d'Ac peuvent ne donner lieu à aucune coloration. La dilution de l'Ac devrait donc être adaptée, dans chaque cas, à la concentration antigénique (d'où l'intérêt très limité des Ac vendus en solution prédiluée).
Avec des concentrations élevées d'Ac primaire, les résultats des techniques immunologiques peuvent se réduire à un bruit de fond intense sans signaux spécifiques. Ces derniers peuvent apparaître après dilution de l'Ac primaire. Ce phénomène, dit de prozone, n'est observé qu'avec les méthodes immunohistochimiques indirectes et témoignerait d'un encombrement stérique, les Ac primaires tassés les uns sur les autres n'étant plus ou peu reconnus par les Ac secondaires. Il apparaît donc que l'efficience de la détection est toujours inférieure à 100 % dans les territoires à forte concentration antigénique et varie avec la densité des Ags. Ces points sont à prendre en considération lors des études quantitatives.
Les modalités du lavage des coupes
La réaction Ag Ac est réversible et, dans la plupart des cas, l'affinité finale de l'Ac dépend très étroitement de la vitesse de dissociation des complexes. Il n'est donc pas étonnant que l'intensité, non seulement du bruit de fond mais également du signal spécifique, dépendent des modalités du lavage (durée, lavage par immersion ou par rinçage à la pissette, composition du tampon). Un lavage trop prolongé, avec un tampon pauvre en sel ou concentré en surfactants, diminue l'intensité de la coloration obtenue avec les Ac d'affinité moyenne ou faible. Il s'agit, là encore, d'une variable à prendre en compte lors des études quantitatives.
LES ADDITIFS
De nombreux produits chimiques peuvent être ajoutés au milieu d'incubation dans le but
 1) de diminuer le bruit de fond en entrant en compétition avec les Ac pour les sites de liaison tissulaire non spécifique (solutions protéiques ou surfactants)
 2) d'améliorer la mouillabilité de la surface de la coupe et donc la pénétration des Ac dans les interstices du système des micropores
3) de perméabiliser les membranes
4) d'améliorer la sensibilité des systèmes de détection immuno-histochimique
5) de stabiliser les Ac et les enzymes.
Ces additifs, pouvant interférer avec la réaction Ag-Ac, doivent être utilisés avec prudence. Ils peuvent en effet interférer avec la réaction AgAc. Les effets d'un co-soluté peuvent s'opposer à ceux d'un autre et le bénéfice d'un mélange ne peut être apprécié que par la pratique. Compte-tenu de la dilution des Ac, les co-solutés présents dans les solutions commerciales d'Ac (sérum de veau fœtal pour les monoclonaux produits en culture, azide de sodium ou merthiolate, etc) n'interfèrent pas avec les résultats.
4.1. Les protéines inertes
Le lait écrémé, l'albumine bovine, le sérum de l'espèce fournissant le deuxième Ac, agissent par compétition pour les sites d'accrochage non spécifique. La composition du lait écrémé et du sérum est, bien entendu, bien plus complexe que celle des solutions albumineuses (qui, cependant, sont souvent loin d'être pures). Il est logique d'utiliser ces protéines en préincubations avant l'Ac primaire. L'albumine est également fréquemment ajoutée aux milieux d'incubation des Ac primaires ou secondaires comme stabilisant des Ac et pour limiter le bruit de fond. Il faut se méfier de la présence, dans ces solutions, de blocage d'une activité protéasique pouvant hydrolyser les Ac. Il convient par ailleurs de vérifier que les Ac secondaires et tertiaires ne croisent pas avec les Ac présents dans les sérums mais également, le cas échéant, dans le lait (le lait de vache contient outre des IgA, des IgG) ou les solutions albumineuses si ces dernières ne sont pas bien purifiées. Utilisées à des concentrations 10 à 100 fois plus élevées que celle des Ac, ces protéines sont majoritaires à l'interface tissu/solution d'incubation. Elles peuvent donc constituer une gène à la diffusion des Ac notamment en cas d'incubation courte.
4.2. Les détergents et surfactants
Des surfactants sont fréquemment ajoutés au milieu d'incubation des Ac et aux solutions de lavage. Ils interviendraient
1)en limitant le bruit de fond lié aux interactions hydrophobes développées entre les sites hydrophobes des Ac et ceux des tissus
2)en améliorant la mouillabilité de la coupe par réduction de sa tension de surface. Ils faciliteraient notamment la pénétration des milieux d'incubation dans le système des micropores
3)en stabilisant les Ac et les protéines enzymatiques et en limitant leur agrégation
4) enfin en perméabilisant les tissus.
Bien que les propriétés physico-chimiques de chaque surfactant soient relativement bien connues, le choix du (ou des) surfactant(s) le(s) mieux adapté(s) à la détection d'un Ag particulier dans un tissu donné reste largement empirique. Les surfactants porteurs de charges positives ou négatives ne sont habituellement pas utilisés car ils se fixent massivement sur les protéines qu'ils dénaturent. Les surfactants dits "doux", non chargés, comme les éthers d'alkylphényl polyoxyéthylène (Triton X100 et le composé fonctionnellement non distinct le Nonidet P-40) ou les esters d'acylpolyoxyéthylène sorbitan comme le Tween 20 ou zwittérioniques (comme le Chaps) sont habituellement préférés. Pour être effectifs, les détergents doivent être utilisés à des concentrations supérieures à une concentration dite concentration critique micellaire (CMC) (Tween 20 CMC : 6.0 mmol/1 ; Mr 1225 ; Triton X- 100 (CMC : 0,24 mmol/1 ; Mr 624,9 et Nonidet P-40 (CMC = 0,29mmol/1, Mr 602,8). Typiquement ces surfactants sont utilisés comme additifs à des concentrations de 0,l à 1 % (v/v) ce qui excède nettement leur CMC. La digitonine, la saponine ou la filipine (5) possèdent, elles aussi, des propriétés détergentes. Elles perméabilisent les membranes en formant avec le cholestérol des pores à travers les membranes (membrane plasmique, Golgi) tout en respectant les membranes pauvres en cholestérol comme celles limitant le réticulum endoplasmique et l'enveloppe nucléaire ou la membrane interne de mitochondries. Au plan pratique, il convient de noter que beaucoup de ces détergents sont des mélanges dont la composition peut varier d'un lot à l'autre, ce qui constitue une source potentielle de non reproductibilité. Il a, par exemple, été démontré jusqu'à 55 composés différents dans un lot de Triton X-100. De plus, beaucoup de ces détergents se dégradent naturellement au cours du temps avec formation de peroxydes et d'aldéhydes pouvant altérer les activités des protéines. Il est donc conseillé de les acheter par petites quantités et de ne pas les conserver trop longtemps. Enfin, il convient de garder à l'esprit qu'utilisés à trop fortes concentrations, ces détergents peuvent inhiber les réactions immuno-histochimiques en dénaturant ou solubilisant l'Ag recherché ou en dénaturant l'Ac.
4.3. Agents de stabilisation des Ac
Un facteur de perte de sensibilité, non négligeable, est la dénaturation ou l'hydrolyse des protéines Ac, notamment pendant les incubations prolongées. La stabilité des Ac peut être améliorée par l'ajout de protéines inertes (comme l'albumine) ou de surfactants dans le milieu d'incubation. Par ailleurs, depuis plus d'un demi-siècle, les biochimistes ont l'habitude de conserver les protéines ou les organites isolés dans du sucrose ou du glycérol concentré (environ 1 M). Nous avons testé l'ajout de concentrations variées de glycérol (5 à 30 %) dans les solutions Ac lors d'incubations prolongées. Pour une majorité d'Ac primaires, d'excellents résultats ont été obtenus à la concentration de 30 % (v/v). En revanche, ce trialcool semble inhiber l'interaction streptavidine biotine. Il vaut donc mieux le réserver aux milieux d'incubation des Ac primaires. Il convient par ailleurs de rappeler que le glycérol potentialise les effets perméabilisants (mais aussi solubilisants des protéines) des détergents. L'hydrolyse protéasique des Ac peut enfin être limitée par ajout dans le milieu d'incubation d'éthylmaléimide (un agent-,alkylant interagissant principalement avec les groupements SH).
4.4. Les sels
Les lois de l'électrostatique nous apprennent que les macromolécules dont la charge nette est de même signe, se repoussent alors que celles de charge opposée tendent à s'associer. Ces interactions électrostatiques peuvent favoriser l'agrégation des protéines (Ac et protéines inertes) dans les solutions d'incubation et le développement d'un bruit de fond par développement d'interactions entre les Ac d'une part et les macromolécules chargées de la coupe d'autre part. De telles interactions peuvent être fortement modifiées par la présence d'ions de petite taille dans les solutions d'incubation. Ces ions constituent, en effet, autour des protéines, une atmosphère ionique de charge opposée formant écran. Plus la concentration des petits ions en solution (la force ionique) est élevée, plus efficient est l'effet écran électrostatique (théorie de Debye-Hückel) (Fig. 11). Les tampons PBS et TBS comportent habituellement du NACI à la concentration de 0,15 M. En cas de bruit de fond, la concentration saline peut être augmentée (0.5 M, la concentration en NACI de l'eau de mer). Il convient, cependant, de noter que ces ions en solution peuvent modifier l'avidité d'un Ac pour son Ag et diminuer ainsi le signal final de la réaction.
5 - LA MISE EN EVIDENCE DES ACTIVITES ENZYMATIQUES
Seuls quelques points seront ici discutés :
- Les enzymes conjugués aux Ac sont relativement instables. Par ailleurs, il est vraisemblable que leurs substrats en solution peuvent former des agrégats. Il apparaît donc logique d'ajouter au milieu d'incubation des surfactants qui, dans le même temps, améliorent la mouillabilité de la surface de la coupe pour la solution de révélation. L'expérience démontre que le gain de sensibilité peut être considérable avec des mélanges comportant du type Tween 20, Saponine et Brij 35 sont utilisés [6].
- Lors de la mise en évidence de l'activité peroxydasique, il est de bonne pratique
1) de limiter l'auto-oxydation de la DAB en réduisant au minimum l'exposition
de ce produit à la lumière et en utilisant des solutions tampons dégazées
2) d'être très attentif à la concentration du peroxyde d'hydrogène.
La gamme des concentrations d'H202 donnant lieu à une activité enzymatique maximale est étroite (Fig. 12). La concentration d'H202 des solutions commerciales est relativement stable, sauf en présence de métaux lourds et il est rare que des échecs de réactions immunohistochimqiues soient liés, sauf erreurs de manipulation, aux vieillissement de ces solutions. En revanche, les volumes utilisés étant souvent très faibles (quelques microlitres), les erreurs de pipetage sont fréquents (présence par exemple de gouttelettes résiduelles sur la face externe des cônes). Il est donc préférable d'utiliser des solutions diluées 6 % (v/v) par exemple au lieu de l'habituelle solution à 30 % (v/v)].
- Lors de la mise en évidence de l'activité de la phosphatage alcaline, il peut être intéressant d'ajouter dans le milieu un polymère inerte de type alcool polyvinylique, ce qui
1) stabilise les substrats de la réaction et permet ainsi des révélations prolongées
2) augmente l'intensité du signal
3) et limite le bruit de fond.
De bons résultats sont obtenus avec l'alcool polyvinylique de masse moléculaire relative moyenne de 40 000 (Sigma) à la concentration de 18 %. Il est important ici de souligner que la concentration des substrats de la réaction enzymatique dans les solutions d'alcool polyvinylique doit être nettement augmentée
 
Bulletin division française de l'AIP juin 1997, n° 25


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