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PROBLEMES LIES A LA TECHNIQUE ANATAMOPATHOLOGIQUE


Les conséquences moléculaires de la fixation et de l'inclusion : exemple des acides nucléiques et des protéines (1).

L'ischémie modifie la composition des tissus avec des variations d'expression du génome. Les premières fragmentations de l'ADN apparaissent en 30 minutes, il existe une grande variation de sensibilité des antigènes à l'autolyse (ainsi le Ki-67 est peu sensible au délai de fixation, alors que la forme phosphorylée de l'histone H3, est très sensible à l'ischémie).
L'intensité des remaniements varie selon le type de chirurgie, et pour les échantillons fixés, avec leurs dimensions, la vitesse de diffusion du fixateur au sein des tissus, en fonction de leur richesse en enzymes hydrolytiques.
Tissus cryopréservés : on note des altérations liées à la cristallisation de l'eau et à des phénomènes osmotiques. Dans les conditions habituelles de congélation des tissus, l'eau cristallise, cette cristallisation dépend des dimensions de l'échantillon et de la vitesse avec laquelle la chaleur est extraite des tissus. Un abaissement lent de la température aboutit à la formation de cristaux de glace massif, peu nombreux, situés préférentiellement dans la matrice extracellulaire. Un refroidissement rapide conduit à une structure cristalline plus fine. Au dessus d'un seuil, qui dépend des tissus (entre - 30 °C et - 80 °C pour le muscle strié squelettique), les cristaux de glace sont en équilibre dynamique avec la solution non congelée dans lequel ils baignent. L'état d'équilibre est celui qui présente le rapport surface/volume le plus petit possible (1 seul cristal de glace) et est irréversible. Des températures < - 80 °C sont donc nécessaires pour que la composition des tissus soit stable. La conservation à - 80 °C est critique, car de petites fluctuations de température dans cette zone peuvent entraîner des phénomènes de fusion recristallisation délétères pour les tissus.
La vérification de la qualité d'un échantillon au cryostat lors de sa congélation ou juste avant son utilisation pour des techniques moléculaires, nzst pas conseillée, car les bénéfices d'une congélation ultrarapide sont perdus. En effet, pour être coupés au cryostat, les prélèvements doivent être portés à une température (- 20 °C à - 30 °C) bien supérieure à la température de transition vitreuse. Si nécessaire, les décongélations doivent être réalisées le plus rapidement possible.
La glace est un mauvais solvant, pendant la congélation, seule l'eau pure cristallise. Au fur et à mesure que la glace se forme, la concentration des solutés dans la portion non congelée de l'échantillon, s'accroît. Comme la cristallisation débute en extracellulaire, la congélation s'accompagne d'une déshydratation cellulaire par mécanisme osmotique. La déshydratation et la rétraction cellulaire qui s'ensuit, se développent en quelques dizaines de secondes. Si la baisse de température est rapide, la déshydratation est limitée.
Les rétractions peuvent entraîner la rupture des membranes plasmiques. Les cristaux peuvent perforer les membranes. Lorsque la congélation est lente (échantillon déposé dans un congélateur à - 80 °C sans refroidissement préalable), la baisse de température est suffisamment lente pour que puisse se développer une mort cellulaire par apoptose.
Lyophilisation de surface : des fluctuations de température (+/- 1,5 °C) peuvent conduire, par l'intermédiaire de cycles " sublimation de l'eau de surface lors du réchauffement et congélation de l'eau sublimée sous la forme de givre lors de la redescente de la température ", à la lyophilisation des couches les plus superficielles de l'échantillon. Elle est plus importante si les échantillons sont de petites dimensions ou lorsque leur surface est irrégulière.
À basse température, une oxydation très lente, avec formation de radicaux libres peut se développer en rapport avec le rapport surface/volume de l'échantillon (plus marqué si petits échantillons ou après lyophilisation de surface).
Fixation : La vitesse de propagation du front de fixation au sein des tissus est inversement proportionnelle à la racine carré du temps écoulé. Un temps long est nécessaire pour que le fixateur atteigne la profondeur des prélèvements de dimensions habituelles en anatomie pathologique. Si la liaison du formaldéhyde avec les tissus est maximale, dans les conditions ordinaires, dès la 24ème heure, il n'en va pas de même de la réticulation macromoléculaire qui est plus lente. Donc : seules les cellules situées en périphérie d'échantillons sont immédiatement fixées, l'ischémie est d'autant plus marquée que les cellules sont situées en profondeur, plus la fixation est courte, plus hétérogènes sont les échantillons, ceux-ci doivent don être minces. La fixation à + 4 °C ralentit les activités enzymatiques.
Modifications protéiques : Les sites intervenant dans les réactions avec le formaldéhyde sont les groupements NH2 terminaux et les fonctions polaires des chaînes latérales des acides aminés, c'est-à-dire les groupements amine, guanidyle, hydroxyle, thiol et les noyaux indole, imidazole et phénol.
Les conséquences sont : insolubilisation de protéines hydrosolubles par réticulation intra et intermoléculaire, l'altération ou blocage de sites réactifs avec modifications des propriétés biologiques (perte ou gain d'antigénicité, perte de toxicité, d'activités enzymatiques).
Modification des acides nucléiques avec adduits hydroxyméthyle. Le formaldéhyde et méthanol présents dans les solutions de formol, en déstabilisant les liaisons hydrogène, participent à la dénaturation de la double hélice. Lors de la fixation, les adduits de formaldéhyde sur l'ADN et les ponts intercaténaires ne se forment que lentement lorsque la fixation est réalisée à température du laboratoire.
Pontages protéines/acides nucléiques, les histones H1 étant les plus aisément pontées à l'ADN. Ces pontages ADN/histones sont moins stables que ceux développés entre 2 protéines.
Aucune enzyme ne peut inverser les modifications macromoléculaires induites par le formaldéhyde. L'amplification des réactions immunohistochimiques après pré-traitement des coupes par une enzyme ne relève pas d'un démasquage par inversion de la fixation. Sur les coupes de tissus fixés au formol et inclus dans de la paraffine, les anticorps ne diffusent pas à l'intérieur des cellules et la réaction antigène anticorps se déroule à la surface de ces dernières. Le traitement enzymatique crée des micro tunnels au sein même des cellules rendant ainsi accessibles des antigènes antérieurement non détectés.
Une inversion partielle des modifications macromoléculaires induites par le formaldéhyde peut être obtenue par une hydrolyse accélérée par la chaleur et/ou une catalyse acido-basique.
Le formaldéhyde en solution tamponnée à pH 7,4 n'hydrolyse pas les acides nucléiques, mais toutes les liaisons formées ne peuvent être rompues. Les acides aminés ou peptides fixés aux acides nucléiques après extraction, perturbent le fonctionnement des enzymes de modification de ces derniers à l'origine d'arrêt ou d'erreur de lecture. Ceci explique, en partie, la taille réduite des produits de PCR observée à partir de tissus fixés au formol par rapport à celle obtenue à partir de tissus congelés, et la fréquence élevée des mutations artéfactuelles non reproductibles observées lors du séquençage d'ADN extraits de tissus fixés au formaldéhyde
Le formol est classé comme cancérogène de catégorie 3 par l’Union Européenne, de groupe 1 selon le CIRC (augmentation significative du nombre de cancers nasopharyngés chez des salariés de l’industrie exposés à des concentrations atmosphériques élevées de formol. L’arrêté du 13 juillet 2006 du ministère de l’emploi rend applicable au formol la réglementation CMR de catégorie 1 ou 2 à compter du 1er janvier 2007. Il n’est pas envisagé de substituer le formol par un autre fixateur. La toxicité des produits de substitution existants n’est pas bien connue. La qualité et la conservation des coupes tissulaires sont moins bonnes avec ces produits. Des mesures organisationnelles doivent être mises en place de manière à s’assurer que tous les échantillons parvenant au secrétariat soient hermétiquement clos. La gestion des déchets de nettoyage doit être organisée. Une amélioration de la ventilation (vitesses d’air plus lentes, modification des bouches) doit être faite afin que le captage des polluants par les tables ne soit plus perturbé. Les niveaux d’exposition au formol doivent être le plus bas possible et tous les agents doivent continuer à bénéficier d’une surveillance médicale renforcée.
La paraffine est le milieu d'imprégnation et d'enrobage le plus utilisé. L'instabilité des tissus des coupes d'échantillons inclus en paraffine conservées à la température du laboratoire est connue, est liée à une auto oxydation radicalaire initiée par un apport d'énergie thermique (la chaleur de l'environnement) ou photochimique (absorption de la lumière). Ces altérations expliquent, la diminution progressive avec la durée du stockage des coupes non déparaffinées des signaux d'hybridation in situ. L'instabilité épitopique des coupes tissulaires stockées est également bien connue mais ses conséquences sur les résultats des techniques histologiques sont variables d'un antigène à l'autre.
(1) Plenat F, Montagne K, Weinbreck N, Corby S, Champigneulle J, Antunes L et al. [Molecular consequences of fixation and tissue processing : the examples of nucleic acids and proteins]. Ann Pathol 2006 ; 26(1):8-21.
 


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