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Caryotype et cytogénétique

méthode d’analyse génétique


Les techniques d’analyse génomique Ann Pathol. 2008 Oct ;28(5):402-8.
Histoire
1882 - Walter Flemming publie les premières illustrations de chromosomes humains
1956 - Identification des 46 chromosomes humains
1959 - Identification de la trisomie 21 du syndrome de Down
1959 - Identification de XXYdu syndrome de Klinefelter(Nature 1959 ;183:302)
1959 - Identification de X0 dans le syndrome de Turner (Lancet 1959 ;1(7075):711)
1960 - Identification du chromosome Philadelphie dans la LMC (J Clin Invest 2007 ;117:2033)
Années 1960- caryotype commun, avec les colorations qui montrent les bandes spécifiques à chaque paire de chromosomes
FISH après développement de marqueurs fluorescents d’acides nucléiques
Cytogénétique constitutionnelle et tumorale :
La cytogénétique conventionnelle reste indispensable à l'étude du génome humain, méthode d'analyse globale du génome permettant, sans orientation préalable, l'identification des remaniements, translocations, gains et pertes de chromosomes ou de segments chromosomiques, mais qui manque de précision pour identifier des anomalies de petite taille, elle nécessite des cellules vivantes proliférantes, donc du matériel frais. Le caryotype est établi à partir de métaphases voire prométaphases. (prélèvement stérile en milieu de transport approprié, acheminé rapidement au laboratoire de cytogénétique à température ambiante.(ni nécrose, ni fixation, congélation, dessèchement ou contamination par des bactéries), d’où la la difficulté d'obtenir une prolifération in vitro pour certains types tumoraux. L'analyse caryotypique qui a été à l'origine de l'identification de la quasi-totalité des anomalies génomiques spécifiques des tumeurs rénales.
Diagnostic constitutionnel prénatal  : si risque familial de pathologie chromosomique (translocation portée par un des parents, âge avancé de la mère, anomalie morphologique à l'échographie). Examen sur liquide amniotique (amniocentèse), voire sur villosités choriales ou sang fœtal.
Diagnostic constitutionnel postnatal  : retard mental, troubles du comportement, dysmorphie, anomalies du développement ou difficultés de procréation.
Diagnostic de tumeurs : certaines présentent des anomalies spécifiques (sarcomes, leucémies/lymphomes (prélèvement de moelle osseuse ou ganglion), tumeurs du rein. L'analyse du caryotype tumoral (inspection visuelle des chromosomes métaphasiques) identifie les anomalies numériques ou structurales équilibrées (translocations réciproques, inversions, insertions) ou non (monosomies, polysomies, délétions, amplifications) . Elle donne une vision d'ensemble des chromosomes et permet de détecter des anomalies inattendues (impossible avec le FISH / PCR car il faut choisir les amorces) et détecte des anomalies en mosaïque et clones cellulaires différents au sein d'une même tumeur. La sensibilité est faible ne détectant pas d’anomalies < 10 mégabases, avec difficulté à identifier avec précisions les anomalies structurales complexes, n’identifie pas le locus d'origine d'une amplification génomique.
L'obtention de métaphases nécessite très souvent une étape de culture cellulaire en incubation humide, à 37°C (quelques heures pour certains prélèvements de sang, de moelle osseuse ou de trophoblaste jusqu'à plusieurs jours, voire plusieurs semaines, pour des prélèvements tissulaires ou de tumeurs solides). Toute contamination bactérienne ou fungique empêche d’obtenir un caryotype (manipulations sous hotte à flux laminaire avec du matériel stérile).
Si prélèvements de sang ou moelle osseuse, la durée d'incubation est < 96 heures sans examen microscopique visuel de l'aspect des cellules.
Si prélèvements amniotiques, durée de culture cellulaire de 5 à 10 jours, on suit quotidiennement l'aspect de la culture au microscope.
Si tumeurs solides, hormis certaines tumeurs à petites cellules rondes qui subissent une incubation de courte durée, si durée de culture courte, la population est représentative de la tumeur sans artefacts in vitro ou prolifération majoritaire du stroma, mais peu de métaphases. Il faut un équilibre entre un nombre suffisant de métaphases et la représentativité de la tumeur (l'examen microscopique quotidien des cultures cellulaires détermine la durée optimale d'incubation (3 à 15 jours). Examen non contributifdans 1/3 des cas (pas de prolifération cellulaire en culture, ou prolifération préférentielle voire exclusive du stroma à caryotype normal).
Au terme de la culture cellulaire : adjonction de colchicine (inhibe le fuseau mitotique), puis d'une solution hypotonique (éclatement des membranes), fixation (mélange d'éthanol ou de méthanol et d'acide acétique), étalement (sauf manipulations effectuées directement sur lames), dénaturation des bandes chromatidiennes et coloration (digestion enzymatique ou chaleur pour dénaturer la chromatine et faire apparaître les bandes chromatidiennes après coloration). Les deux techniques de dénaturation-coloration les plus utilisées en routine sont les bandes "GTG" et "RHG".
Technique "GTG" qui apparaître des bandes foncées, dites "G", = régions de réplication tardive, après dénaturation par la trypsine "T" et coloration par le Giemsa "G".
Technique "RHG" qui fait apparaître des bandes "R" (reverse, négatif des bandes G) après traitement par la chaleur ("H pour heat) et coloration par le Giemsa.
Après coloration, les lames de préparations chromosomiques métaphasiques sont examinées au microscope. En diagnostic constitutionnel prénatal ou postnatal, on sélectionne 16 à 20 métaphases avec chromosomes bien individualisés et des bandes chromatidiennes contrastées.
Un nombre de 400 bandes par lot haploïde est considéré comme suffisant, détecte des anomalies structurales >10 mégabases d'ADN. En oncologie, moins de métaphases interprétables et moins de 400 bandes par lot haploïde, on recherche des anomalies caractéristiques d'un type tumoral, même dans un nombre restreint de cellules.
Les chromosomes sont identifiés par leur taille et la répartition des bandes chromatidiennes et la position de leur centromère (zone d'attachement des 2 chromatides sœurs) par rapport aux télomères. Les chromosomes métacentriques (1, 3, 19) ont 1 centromère à égale distance des télomères, les chromosome sub-métacentriques ou télocentriques ont 1 centromère plus proche d'une extrémité (8, 9, 10), les chromosomes acrocentriques ont 1 centromère près d’un télomère (13, 14, 15,21 et 22).
Le caryotypage, se fait avec des outils numériques, des logiciels font un préclassement automatique, le classement exact des chromosomes requiert un opérateur expérimenté.
Après revue, il est parfois nécessaire d’analyser des métaphases supplémentaires ou de techniques moléculaires pour mieux caractériser une anomalie.
 
Les anomalies chromosomiques sont numériques ou structurales. Les anomalies constitutionnelles, numériques ou structurales, sont souvent simples, touchant rarement plus de 2 chromosomes. Leurs déséquilibres n'affectent que des segments chromosomiques de taille modérée (sinon incompatibles avec la vie).
Certains caryotypes tumoraux présentent des anomalies simples dont la découverte, surtout dans les leucémies et certains sarcomes, a été capitale pour l'aide au diagnostic et l'identification de gènes cibles. De nombreuses anomalies numériques et structurales peuvent coexister dans les cellules tumorales
 
En pathologie constitutionnelle postnatale, les trisomies autosomiques ne concernent que les chromosomes 13, 18 et 21. Les gains ou pertes des chromosomes X et Y sont également fréquentes. En pathologie tumorale, les gains et pertes peuvent être multiples avec des tétrasomies, pentasomies, voire nullisomie (perte d'une paire chromosomique) et peuvent toucher simultanément plusieurs paires chromosomiques. Certaines anomalies numériques touchent tout un lot haploïde entier (tri- ou tétraploïdie).
Les polyploïdies constitutionnelles ne sont pas viables (fausse-couches). Les hypoploïdies sont rares observées en pathologie tumorale.
Les anomalies structurales sont secondaires à des translocations par déplacement ou perte d'un fragment chromosomique. Elles peuvent être équilibrées (ni gain ni perte de matériel génétique (translocation = échange de fragments chromosomiques entre 2 ou plusieurs chromosomes, ou inversion, par délocalisation d'un fragment chromosomique au sein d'un chromosome donné)), ou non équilibrées (gains ou pertes chromosomiques partielles par des translocations ou inversions, délétions et duplications.
L’amplification génomique (exclusivement tumorale), se traduit par de nombreux chromosomes minuscules (double minutes), des chromosomes en anneau (parfois chromosome dont les télomères ont fusionné et donc non amplifié), de volumineuses régions chromosomiques, appelées "hsr" (pour "homogeneously staining région", qui est un misnommercarces régions comprennent des bandes contrastées)
L'écriture de la formule chromosomique se fait selon une nomenclature internationale (2005). Elle indique le nombre de chromosomes, puis le nombre et le type des chromosomes sexuels et enfin, le cas échéant, les anomalies numériques ou structurales (ex normal : 46,XX pour une femme et 46,XY pour un homme, une trisomie 21 chez une femme sera écrite 47,XX,+21 chez un homme sera écrite 45,XY,-3. Si anomalies en FISH cela transcrit dans la formule chromosomique. Le bras court = p de ‘petit’ et le bras long = q, le sigle 1p36.2 indique la deuxième sous-bande au sein de la sixième bande de la troisième région du bras court du chromosome 1. Cette codification est utilisée pour indiquer les points de cassure sur un chromosome en cas d'anomalie structurale. Par exemple, la formule 46,XX,t(3 ;12)(q28 ;ql4) indiquera la présence d'une translocation réciproque équilibrée entre un chromosome 3 et un chromosome 12 chez une femme. Sur le chromosome 3, le point de cassure aura eu lieu au niveau de la huitième bande de la deuxième région du bras long et sur le chromosome 12, la cassure aura eu lieu au niveau de la quatrième bande de la première région du bras long.
 
Cytogénétique moléculaire directe : Hybridation in situ en fluorescence ou "FISH
L'analyse par FISH indique la localisation de gènes et de fragments chromosomiques de tailles diverses, en combinant plusieurs fluorochromes on identifie simultanément la position et les altérations de plusieurs séquences géniques ou chromosomiques.
Avantages : facilité relative de préparation des échantillons et de leur analyse, spécificité élevée, peut être fait sur matériel inclus en paraffine (comparaison possible avec l’histologie).
Applications : diagnostic prénatal, conseil génétique, oncologie (translocations), recherché fondamentale, cartographie génique, identification de pathogènes
Echantillons : tumeurs solides, aspirations médullaires, sang périphérique (lymphocytes), liquide amniotique (amniocytes), peau (fibroblastes), villosités choriales. Une décalcification aux ultrasons permet la FISH, PCR et RT-PCR (AJSP 2006 ;30:892)
Cibles  : séquence nucléotidique spécifique d’une région chromosomique ou spécifique de quelques maladies(visualise les délétions, par ex BCR/ABL transcrit de fusion de t(9 ;22)(q43 ;q11.2) de la LMC). Séquences centromériques ou subtélomériques (modifications de chromosomes dans les cancers anomalies congénitales retard de croissance)
 
Elle identifie les points de cassure par clonage positionnel et obtient des informations chromosomiques et géniques sur noyaux cellulaires en l'absence de caryotype, avec son application indirecte : l'hybridation génomique comparative (CGH et array-CGH) elles sont un complément de la cytogénétique. C’est une technique d'examen ciblée sur une région spécifique du génome potentiellement remaniée. Elle doit être orientée par les caractéristiques histopathologiques de la tumeur de façon à permettre le choix de la sonde.
En FISH on apparie par complémentarité 2 séquences homologues d'ADN : la cible et la sonde. L'ADN de la sonde contient des nucléotides et une molécule fluorescente ou un haptène qui fixera une molécule fluorescente lors de l'étape de révélation. La fluorescence permet de localiser sur un chromosome la séquence d'ADN complémentaire.
Pour apparier la sonde il faut une étape de dénaturation par la chaleur ou traitement alcalin. L'adjonction de formamide permet d'abaisser la température de dénaturation pour ne pas dégrader l'ADN. On dépose le mélange réactionnel sur la lame et on dénature sur une plaque chauffante pendant 1 à 3 minutes. L'étape d'hybridation, dure plusieurs heures (généralement une nuit) à 37°C apparie les 2 ADN. Puis suite de rinçages, plus la stringence sera forte (température élevée et concentration saline faible), plus le rinçage sera efficace, et moins se maintiendront des hybridations non spécifiques. Mais 1 rinçage trop stringent peut défaire des hybridations spécifiques. Il faut 1 équilibre pour éviter le bruit de fond des hybridations non spécifiques tout en maintenant le signal spécifique solide et donc bien visible.
Lorsqu'un fluorochrome est incorporé dans la sonde, l'étape de rinçage sera suivie directement par le montage de la lame avec 1 goutte de solution avec 1 produit empêchant l'extinction de la fluorescence (anti-fading) et des colorants de l’ADN (DAPI, coloration bleue) ou l'iodure de propidium (coloration rouge) qui visualisent les chromosomes et les noyaux. Lorsqu'un haptène non fluorescent, comme la biotine ou la digoxigénine, a été incorporé à l’ADN, il faut 1 étape de révélation après les rinçages et avant le montage de la lame (immunomarquage avec 1 ligand couplé à une molécule fluorescente, qui se liera à l’haptène (couple biotine- avidine, couplée à un fluorochrome, digoxigénine- Ac antidigixigénine + fluorochrome. On peut renforcer l'intensité du signal fluorescent par des réactions d'immunofluorescence successives de type "sandwich"'.
FISH "directe", la cible est localisée soit sur un chromosome métaphasique (étape de culture cellulaire), soit interphasique dans un noyau sur cytologie ou coupe histologique. Il faut des sondes > 2-3 kilobases pour des hybridations de qualité. Les très grandes sondes s’apparient sur chromosomes métaphasiques, car sinon le signal sur noyaux est trop flou et diffus pour être analysé.
CISH lorsqu'on utilise un chromogène au lieu de la fluorescence (chromogenic in situ hybridization), ne nécessite pas d’équipement de fluorescence, et préserver mieux la morphologie histologique.
Pour la FISH métaphasique, les préparations chromosomiques obtenues par techniques cytogénétiques conventionnelles, sur lames peuvent être conservées au froid dans de l'éthanol à 70% pendant plusieurs mois.
En FISH interphasique, les lames de suspensions cellulaires, cryocoupes ou appositions peuvent aussi être conservées au froid dans de l'éthanol à 70% avant dénaturation.
Empreintes : permettent une FISH rapide (après vérification de la qualité de la préparation, lames conservées dans l'alcool au réfrigérateur, transport à température ambiante par courrier ordinaire après séchage). Suspension cellulaire fixée :  après dissociation tissulaire, avant mise en culture cellulaire, une petite fraction de la suspension cellulaire est fixée après étalement sur lames (3 volumes de méthanol pour un volume d'acide acétique glacial).
Pour les lames histologiques : bains de xylène pour déparaffiner, puis déprotéinisation ménagée avec la protéinase K et la pepsine, qui conditionne le succès de la FISH. Si déprotéinisation insuffisante, alors auto-fluorescence nette, résidus qui gênent la visualisation du signal de la sonde. Si déprotéinisation trop importante : noyaux altérés ou fantômes. Influence de la durée de la durée de la fixation formolée avant inclusion en paraffine. Taux d'échec de la FISH sur coupes fixées de 15%. Si la densité cellulaire est importante, l'interprétation, et surtout la numération des signaux fluorescents dans chaque cellule peut être difficile, voire impossible. Dans ce cas, suspension nucléaire (coupes de 50 µ) étalée sur lames avant FlSH (la dissociation permet une meilleure visualisation des cellules et un compte plus précis des signaux fluorescents). Son interprétation peut être délicate, du fait de l'aneuploïdie des tumeurs ainsi pour her2, en cas de surexpression, on recourt à une FISH sur le centromère 17 pour effectuer un ratio nombre de copies de her2/nombre de chromosomes 17.
 
FISH indirecte : CGH (comparative genomic hybridization), le génome à étudier est utilisé comme sonde (fluorescence rouge), sur un support cible témoin normal (fluorescence verte),. Elle montre des amplifications (rapport de fluorescence rouge (tumoral) / vert (normal) > 1.2) / délétions (rapport de fluorescence rouge (tumoral) / vert (normal) < 0,8). Le rapport des 2 fluorescences le long des chromosomes renseigne sur les gain ou pertes génomiques de l'ADN tumoral versus l'ADN contrôle avec résolution de 10-20 mégabases. Les supports actuels (millions d'oligonucléotides couvrant l'ensemble du génome) permettent 1 résolution de quelques dizaines de paires de bases. Les remaniements équilibrés (translocations) échappent par définition à l'analyse. La technique nécessite, pour un résultat optimal, un prélèvement tumoral frais ou congelé, à partir duquel l'ADN sera extrait. Des résultats ont été toutefois obtenus à partir de matériel fixé dans des conditions rigoureuses en formol neutralisé et inclus en paraffine.
La CGH utilisait des chromosomes métaphasiques normaux provenant de cultures lymphocytaires de donneurs sains, mais difficile à réaliser et manque de résolution (une bande chromosomique = 10 Mb).
Elle est remplacée par la CGH sur biopuces d'ADN (array-CGH).
L'hybridation du mélange de sondes est réalisée sur des spots d'ADN génomique de 150 Kb chacun couvrant tout le génome (clone/Mb), ces lames peuvent contenir 5000 clones déposés en 3 ou 4 exemplaires = puces à ADN. La résolution est à la taille du clone près (100-150 Kb).
Les puces à oligonucléotides sont constituées d'oligomères de 60 à 80 paires de bases déposés ou directement synthétisés sur la lame permettant ainsi une résolution moyenne de 1Kb (jusqu'à 2 millions d'oligonucléotides par puce).
La première étape consiste à marquer les 2 ADN à comparer (ADN de qualité équivalente). Après digestion enzymatique, 1 µg de chaque ADN est marqué avec des cyanines (Cy5 pour l'ADN tumoral, Cy3 pour l'ADN contrôle) dans une réaction de "Random priming" avec synthèse d'ADN à partir d'amorçages aléatoires de "primer" dégénérés s'hybridant sur l'ADN simple brin. On obtient alors un ADN double-brin fluorescent sous forme de fragments allant de 100 à 1000 paires de bases. Ces 2 sondes sont ensuite mélangées avec de l'ADN Cot-1 pour saturer les séquences d'ADN répété (sans cela, celles-ci s'hybrideraient de manière non spécifique sur le génome cible) puis hybridées durant 24 à 48 heures sur la lame.
Après lavages stringents post-hybridation la puce est scannée sur les 2 longueurs d’onde des cyanines (635nm pour Cy5 et 532 nm pour Cy3), l’image est acquise et numérisée après élmination des spots non valides et application d’un coefficient de normalisation.
La array-CGH ne détecte pas les anomalies structurales équilibrées, possibilité de dilution de l'ADN tumoral par l'ADN non tumoral. Elle ne fait pas encore partie des méthodes de routine
Ces 2 évolutions techniques sont prometteuses en principe mais posent d’importantes questions, comment gérer le flux impressionnant de données (bio-informatique) et l’information recueillie est quantitative et non qualitative, car une bonne partie de l’ADN n’est pas traduit, ou les anomalies décrites n’ont aucun rapport avec la pathologie testée. Jusqu’à présent malgré les moyens énormes débloqués, les résultats sont maigres, de plus il n’existe pas de standardisation des puces proposées
 
Sondes de peinture chromosomiques, elles couvrent tout/partie d'un chromosome. Elles montrent des chromosomes anormaux non identifiables par les techniques conventionnelles et les altérations chromosomiques complexes. Elles ne détectent pas les inversions et les délétions. L'utilisation simultanée de sondes marquées par des fluorochromes différents permet d'établir des caryotypes en "24 couleurs", une pour chacun des 22 autosomes et les chromosomes X et Y, selon 2 principes différents, la "multi-FISH" ou le caryotype spectral.
Les centromères humains contiennent des motifs d'ADN répétés (alpha-satellites), souvent spécifiques d'un chromosome. Les sondes centromériques donnent un signal fluorescent intense, et permettent rapidement des numérations chromosomiques métaphasiques ou interphasiques, identifient des anomalies des centromères (chromosomes acentriques, dicentriques,...).
Les sondes télomériques, aspécifiques s'hybrident à tous les chromosomes (motif répété TTAGGG) et estiment les modifications télomériques quantitatives, les sondes subtélomériques, sont locus-spécifiques, localisées immédiatement en position proximale par rapport aux télomères.
Les sondes subtélomériques montrent de petits remaniements, pouvant passer inaperçus au caryotype, causes de retards mentaux "inexpliqués". Elles sont utilisées en couples bicolores des bras p et q.
Les sondes locus-spécifiques sont produites en quantité par des vecteurs (chromosomes bactériens artificiels ou BAC, cosmides, plasmides, chromosomes artificiels de levure (YAC)) Elles détectent des anomalies quantitatives (duplications, délétions, amplifications ainsi que des fusions ou fissions géniques.
 
En diagnostic constitutionnel prénatal : les sondes permettent la recherche des anomalies numériques les plus fréquentes (21, 13 et 18, anomalies de nombre du chromosome X). Pour les chromosomes X et 18, avec des sondes centromériques, mais pour les chromosomes 13 et 21 (séquences centromériques non spécifiques) avec des sondes spécifiques d'un locus de leurs bras longs respectifs.
En diagnostic constitutionnel postnatal : sondes régions impliquées dans les syndromes microdélétionnels les plus fréquents, comme :
- la région du syndrome de DiGeorge / syndrome vélo-cardio-facial en 22ql 1
- celle des syndromes d'Angelmann et de Prader-Willi en5qll
En oncologie : sondes d’une altération génique structurale (fusion anormale de 2 gènes, fission d'un gène, siège du point de cassure d'une translocation) ou détectant une altération numérique (amplification (> 5 copies d'un gène) ou délétion.
 
Les études sur les sarcomes ont montré qu’il existe 20% de sarcomes à profils génomiques simples avec co-amplifications de 12q14-21 soit avec 1p32 soit 6q23
Les amplifications du chromosome 12 ciblent les gènes MDM2 et CDK4, ce qui a permis de les reclasser en liposarcomes dédifférenciés. Un second groupe est constitué de tumeurs remaniées avec en CGH de nombreux gains et pertes chromosomiques et fréquente perte d'une partie/totalité du chromosome 13 ciblant le gène Rb ce qui pourrait correspondre à des léiomyosarcomes indifférenciés.
 
L'analyse des partenaires de co-amplification des liposarcomes dédifférenciés a montré l'activation de la voie JNK avec à la clé un essai thérapeutique, dans les liposarcomes dédifférenciés, d'une molécule (Aplidin®, Pharmamar) induisant l'apoptose par l'activation de la voie JNK.
Dans le groupe de sarcomes très remaniés (sarcomes indifférenciés et léiomyosarcomes), de fréquentes délétions du gène PTENont pu être identifiées. Ceci permet d'envisager l'utilisation clinique d'inhibiteurs de la voie mTOR spécifiquement dans ce type de tumeurs présentant cette altération.
 
Images de FISH : sein et amplification HER2 - IHC, CISH, FISH ; FISH amplification #1 ; #2 ; #3 ; #4, IHC et FISH ; not amplified-FISH ; not amplified-CISH and FISH, carcinome sécrétoire - t(12 ;15), durant une grossesse - FISH shows cells from male fetuses within tumor
 
Rein : néphrome mésoblastique congenital t(12 ;15)(p13 ;q25) avec transcrit ETV6-NTRK3, figures E and F : adénome papillaire rénal : trisomie 12
LMA avec inv(16)(p13 ;q22) / t(16 ;16)(p13 ;q22) - H&E, cytogenetics and FISH ; H&E, RT-PCR and FISH
LLC - trisomie 12, FISH avec 3 signals verts dans 2 cellules à droite ; Lymphome du manteau - t(11 ;14)(q13 ;q32), fusion BCL1/cyclin D1 et IgH - H&E, stains, FISH ; - t(8 ;14)(q24 ;q32.3), fusion c-myc / IgH (rare), figure 4A
Tumeur myéloïde avec réarrangement : FGFR1, PDGFRB - #1, #2, LLA préB avec t(9 ;22)(q34 ;q11) bcr-abl
Chondrome - FISH + réarrangement HMGA2, DFSP - COL1A1-PDGFB - H&E + FISH
fibrosarcome infantile- t(12 ;15)(p13 ;q25), - fusion ETV6 / NTRK3, pseudotumeur inflammatoire : ALK, FISH + caryotype ; FISH (ALK), synovite pigmentée villonodulaire – trisomie 5 et 7, sarcome synovial : t(X ;18)(p11.2 ;q11.2), fusion SYT / SSX1 ou SSX2 - FISH
glioblastome, léiomyomatose intraveineuse - t(12 ;14)(q14-15 ;q23-24), fusion
 
PCR et RT-PCR : Les techniques d'amplification d’acides nucléiques par PCR ("Polymerase Chain Reaction") peuvent être réalisées sur ADN ou sur ARN (RT-PCR) ou Reverse Transcriptase PCR qui consiste en une PCR réalisée sur un ADN complémentaire (ADNc) obtenu après transcription inverse de l'ARN.
De par sa capacité à amplifier spécifiquement une très faible quantité d'ADN, cette technique d'amplification est tout particulièrement appropriée à l'analyse de fragments tissulaires ou de culots cellulaires.
La possibilité de mesurer en continu la quantité d'ADN total produite lors de l'amplification (grâce à un marqueur fluorescent) a permis le développement de la PCR quantitative (qPCR) ou PCR en temps réel ("real-time PCR").
Programme de PCR classique
- 95°C pendant 10 à 15 minutes (en cas d’enzyme "Hot Start")
- environ 40 cycles composés de : 95°C pendant 30 secondes (étape de dénaturation) ; Tm +2 °C (par ex :55°C) pendant 1 minute (étape d’hybridation ou annealing) ; 72°C pendant 1 minute (étape d’élongation)
- 72°C pendant 5 minutes
- 40°C pendant 1 minute ("cooling")
Note : l’étape d’élongation dépend de la longueur attendue du fragment à amplifier. On considère que la Taq polymérase synthétise environ 1000 bases/minute. Pour une longueur attendue de 500 pb, 30 secondes d’élongation sont suffisantes
La possibilité de mesurer en continu la quantité d'ADN total produite lors de l'amplification (grâce à un marqueur fluorescent) a permis le développement de la PCR quantitative (qPCR) ou PCR en temps réel ("real-time PCR"). Le principe de la qPCR est d'utiliser un agent qui fluoresce au fur et à mesure des cycles de PCR. Le temps d'apparition et l' intensité de la fluorescence permettent une évaluation semi-quantitative de l'ADN amplifié.
On peut utiliser :
 - un agent intercalant fluorescent : SYBER Green I ou II
 - une sonde munie d'un fluorophore et d'un quencher. L'analyse de la fluorescence est réaliée par les automates de q PCR.
La PCR montre la clonalité de lymphomes en montrant des ré-arrangements des immunoglobulines ou des gènes du récepteur T. Une mutation du gène KRAS dans les cancers colorectaux a une valeur prédictive dans la réponse au traitement par des anticorps anti-EGFR.
 
Tumeurs
Anomalie recherchée
Type d’étude et de matériel
LNH b
Réarrangement des IgH
PCR sur ADN
LNH T
Réarrangement TCR
PCR sur ADN
Lymphome folliculaire
t(14 ;18)(bcl2 ;IgH)
PCR sur ADN
Lymphome du manteau
T(11 ;14)(Bcl1 ;IgH)
PCR sur ADN
CCR TTT anti EGFR
Mutation de Kiras
PCR sur ADN
CCR syndrome HNPCC
Instabilité microsatellitaire
PCR sur ADN
CCR syndrome HNPCC
Méthylation MLH1
PCR sur ADN
Oligodendrogliomes
Délétion 1p et 19q
PCR sur ADN
K non à petites cellules (poumon)
Mutations EGFR
PCR sur ADN
synovialosarcome
t(X ;18)(SYT ;SSX)
RTPCR sur ARN
Ewing
t(11 ;22)(EWS, FLI), t(21 ;22)(EWS, ERG) etc
RTPCR sur ARN
rhabdomyosarcome
t(2 ;13)(PAX3, FKHR), t(1 ;13)(PAX7-FKHR)
RTPCR sur ARN
LPS myxoïde
t(12 ;16)(TLS-CHOP),t(12 ;22)(EWS-CHOP)
RTPCR sur ARN
Sarcome fibromyxoïde
t(7 ;16)(FUS-CRE3L2), t(11 ;16)(FUS-CREB3L1)
RTPCR sur ARN
Sarcome à cellules claires
t(12 ;22)(EWS-ATF1)
RTPCR sur ARN
GIST
Mutations kit et PDGFRA
PCR sur ADN
 
 
Méthodologie
Extraction d'ADN et d'ARN à partir des tissus et des cellules : Les tissus congelés et culots de cytocentrifugation permettent une bonne qualité d'ADN ou d'ARN. La majorité est effectuée sur tissus fixés et inclus en paraffine ; les ponts nucléoprotéiques de la fixation rendent difficile l'accessibilité à la matrice nucléique et donc l'extraction de l’ADN et de l’ARN cellulaires. Le pathologiste choisit le bloc de tumeur le plus riche en cellules tumorales et, si nécessaire, sélectionne la zone tumorale la plus riche qui devra être extraite.
- Amplification par PCR  : elleamplifie in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l'étudier. La PCR est une suite de cyclesen boucle avec chacun 3 étapes :
- dénaturation de l'ADN double brin à 95°C
- hybridation d'un couple d'amorces aux brins d'ADN simple brin à 50-60°C
- polymérisation grâce à la Taq polymérase à 72°C.
Les produits de fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant. L'amplification est donc exponentielle. La réaction de PCR est rapide (2 à 3 heures pour une PCR de 40 cycles). L'ADN ou l'ARN extraits de tissu fixé au formol et inclus en paraffine sont significativement dégradés et il paraît donc inutile d'essayer d'amplifier de longs fragments > 300 paires de bases, bons résultats entre 80 et 250 paires.
- Méthode d'analyse : Après la réaction de PCR, les produits d'amplification sont séparés par électrophorèse dans des gels d'agarose ou d'acrylamide, puis colorés, ceci afin de déterminer leur taille ou leur abondance.
Cette analyse directe des produits de PCR par électrophorèse permet de mettre en évidence des réarrangements, des translocations, des délétions et des instabilités microsatellitaires. Par contre, pour la mise en évidence de mutations ponctuelles ou de méthylation de l'ADN, d'autres techniques d'analyses plus complexes sont nécessaires comme le séquençage, l'analyse par SSCP ("Single Strand Conformation Polymorphism") ou la digestion avec des enzymes de restriction.
 
Depuis l'été 2008, la recherche des mutations du gène KRAS dans les adénocarcinomes lieberkuhniens colorectaux est un test prédictif du traitement par erbitux. KRAS est un oncogène humain homologue d'un gène transformant isolé à partir du "Kirsten RAt Sarcoma virus", situé en 12pl2.1 qui joue un rôle d'effecteur sur de nombreuses voies de transduction. Des mutations de KRAS sont retrouvées dans de nombreuses tumeurs (35 à 40% des cancers colorectaux). Ces mutations somatiques entraînent une stabilisation de la liaison au GTP, avec activation constitutive découplée de la fixation du ligand à son récepteur en amont. Les mutations les plus fréquentes sont au niveau des codons 12 et 13 de l'exon 2. Ces mutations de KRAS sont prédictives de l'absence de réponse aux Ac monoclonaux anti-EGFR (Erbitux et Vectibix (Panitumubab) dans les adénocarcinomes colorectaux. D’où la nécessité de rechercher les mutations du gène KRAS avant de prescrire ces molécules chez des patients affectés d'un cancer colorectal au stade métastatique.
Pour que le test soit valide, il faut > 20 à 30% de cellules tumorales dans le prélèvement.
Analyse par PCR en temps réel avec des sondes spécifiques des mutations recherchées, analyse par séquençage, pyroséquençage ou extension à partir d'amorces spécifiques des nucléotides C.34G, C.35G, C.37G et c.38G (technologie SNaPshot®).


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