» Laboratoire de pathologie Techniques de cytologie

Techniques de cytologie


LABORATOIRE D’ ANATOMIE PATHOLOGIQUE _ Centre François Baclesse
 
TECHNIQUES DE CYTOLOGIE : Hervé Quintard Cytotechnicien I.A.C.
 
Les différents prélèvements cytologiques reçus au laboratoire
Prélèvements gynécologiques : Frottis cervicaux et endométriaux arrivent en étui protège-lame et déjà fixés par une laque fixatrice.
Prélèvements de ponction mammaire : étalements effectués dans les services et arrivant déjà fixés en étui protège-lame. Liquides de kyste mammaire arrivant frais au laboratoire.
Prélèvements d’ origine bronchique : aspiration et lavages bronchiolo-alvéolaire arrivent frais au Labo
Liquides d’épanchements des séreuses et de kystes des différents organes et urines : les liquides pleuraux , péritonéaux et péricardiques et autres arrivent frais au laboratoire .
Les LCR :  arrivent frais au laboratoire
Les prélèvements de ponction thyroïdienne : ces cytoponctions parviennent au laboratoire dans un liquide fixateur (sedfix), les liquides de kystes thyroïdiens doivent parvenir frais au laboratoire
Les cyto-ponctions ganglionnaires. Ils arrivent soit déjà étalés et fixés ( laque fixatrice) par les soins du médecin préleveur dans un étui protège lame .
Soit les étalements sont effectués en consultation où au lit du malade par le cytotechnicien et fixés par ses soins avec le fixateur approprié ou lames sèche pour coloration en MGG
Cette dernière technique a l’avantage de permettre d’apprécier la quantité et la qualité macroscopique du prélèvement et de transmettre cette information en temps réel au médecin préleveur afin d’effectuer un éventuel second prélèvement.
Les ponctions d’organe profond : Ces ponctions concernent tous les types d’organes accessibles par un aiguille biopsique sous contrôle d’un appareil d’imagerie médicale (échographe ou scanner ) Les principaux organes ponctionnés sont le foie et le poumon
Les étalements sont effectués dans la salle d’imagerie par le cytotechnicien et fixés par ses soins avec le fixateur approprié. Cette technique a l’avantage de permettre d’apprécier la quantité et la qualité macroscopique du prélèvement et de transmettre cette information en temps réel au médecin préleveur afin d’effectuer un éventuel second prélèvement.
 
LES FIXATEURS CYTOLOGIQUES EMPLOYES AU LABORATOIRE
Fixateur hydrosoluble en bombe aérosol : Celui utilisé au laboratoire est le « Labofix » de chez Labonord en bombe de 200ml .
Il est employé dans tous les services du Centre qui sont appelés à faire des frottis cytologiques en remplacement de l’alcool éther utilisé précédemment et jugé trop dangereux à la manipulation et au transport et seulement encore utilisé dans l’enceinte du laboratoire de cytologie .
Il est utilisé pour fixer : les frottis gynécologiques, les cyto-ponctions mammaires, ganglionnaires, et des organes profonds . Les étalements des liquides parvenus frais au laboratoire et n’ayant pas fait l’objet d’une préfixation avant centrifugation ( liquide pleural, ascite, kystes.)
Temps de fixation : 3 minutes
 
Le Sedfix : Ce fixateur liquide est fabriqué au sein du laboratoire à base d’un liquide concentré fourni par la société Surgipath à base d‘éthanol, de Polyéthylène glycol, de méthanol et d’isopropanol. Il est utilisé :dans les cytoponctions de thyroïde et est donc fourni aux différents services du Centre qui effectue ces prélèvements (Imagerie médicale et Médecine nucléaire) dans les liquides pauci-cellulaire ou il intervient dans la dernière phase de centrifugation afin de réduire la perte cellulaire liée aux étalement et à la fixation classiques ( Labofix). R5emplacé actuellement par le cyto-rich
Mode de fabrication du SEDFIX
 
Pour environ 950 ml de solution :
96 ml de Sed Fix Concentrate ( Fabricant Surgipath ,Fournisseur Labonord )
425 ml d’H2O distillée
425 ml d’Ethanol à 95°
Agiter. A utiliser en partie égale avec le matériel à fixer. Temps de fixation 15 minutes
 
L’alcool éther : Fixateur historique de la cytologie au laboratoire il n’est quasiment plus utilisé si ce n’est dans un cas : la cytologie broncho pulmonaire. En effet l’épaisseur des étalements et leur aspect souvent hémorragique et mucoide ne permettent pas d’utiliser le Labofix qui ne donne pas la qualité de fixation adéquat. Il est aussi parfois utilisé dans les cytoponctions d’organes profonds en salle d’imagerie car sa rapidité de fixation et le fait qu’il suffit de plonger les lames dans l’alcool éther procure au cytotechnicien une rapidité dans l’exécution des taches de recueil des différents prélèvements.
Mode de fabrication : Alcool éthylique à 95° : 1 vol, Ether sulfurique : 1 vol
Temps de fixation : 10 minutes
 
Le cytorich red : fixateur fourni par la société « Thermo Shandon » est une solution de fixation alcoolique et hémolytique avec différents alcools et du formaldéhyde. Il est utilisé au laboratoire pour ces propriétés hémolytiques et de solubilité des protéines dans les cas de liquides très hémorragiques et mucoïdes et pour l’instant réservé aux cytologies bronchiques. mais en parallèle avec l’alcool éther Une étude pour l’amener à remplacer le « Sedfix » dans les cytologies thyroïdiennes est actuellement en cours. Temps de fixation et d’hémolyse : de 15à 30 minutes
 
L’ Alcool-Formol-Acetique ou AFA : Ce fixateur qui porte sa composition dans son nom n’est utilisé au laboratoire que dans un seul but : fixer les restes des culots de centrifugation abondants pour technique d’inclusion en paraffine des prélèvements histologiques Ses propriétés procoagulantes permettent de manipuler les culots comme un prélèvement biopsique
Temps de fixation : il dépend du volume et de la densité du culot à fixer mais au minimum plusieurs heures
AFA : Pour 310ml de fixateur : Alcool éthylique absolu = 150 ml, Formol à 40 % = 60 ml, Acide acétique = 15 ml, H2O distillée = 75 ml
 
Réception des prélèvements
Le technicien réceptionne la totalité des prélèvements cytologiques reçus au laboratoire .Il vérifie l’identification du prélèvement avec le bon de demande d’examen joint. En cas de problème il renvoie le prélèvement dans le service concerné en précisant les raisons de ce renvoi. Il note sur le bon de demande d’examen l’aspect, la quantité et la couleur du liquide ou le nombre d’étalements transmis. Il procède ensuite à l’enregistrement informatique du prélèvement .
 
Techniques d’élaboration des étalements
Etalements classiques . effectués en consultation , au lit du malade , en salle d’imagerie et au laboratoire pour les prélèvements suivants : frottis gynécologiques, cytoponctions diverses, aspirations bronchiques et les L.B.A., urines avec une densité cellulaire importante, liquides de kystes avec une densité cellulaire importante
Technique : Identifier toutes les lames en utilisant un crayon de papier ou un feutre résistant aux solvants.
Confectionner le frottis en déposant une petite quantité de matériel sur une des lame et retourner une autre lame en sens inverse afin de faire diffuser le matériel entre les deux épaisseur de verre . appuyer légèrement si besoin . retourner les lames afin de juger visuellement de la qualité du frottis
Utiliser la bombe de fixateur immédiatement après la confection du frottis en la tenant au minimum a 20 cm de la lame et en exerçant 3 à 4 pressions
Ne jamais faire sécher le prélèvement sur la lame
En cas de lames multiples, fixer au fur et a mesure de la confection des lames
Ne jamais tenir la bombe a moins de 20 cm du frottis a fixer
Déposer les lames fixées dans l étui plastique
 
La centrifugation classique : utilisée sur prélèvements liquides pour obtenir des culots cellulaires et élaborer des étalements classiques et des inclusions de matériel cytologique en paraffine.
Technique : on utilise des tubes coniques et on centrifuge à 2000 tours/min pendant 15 minutes. On centrifugera la quantité de liquide nécessaire pour l’élaboration des étalements ainsi que pour l’obtention d’ un culot qui sera fixé en AFA pour une inclusion en paraffine
 
La cyto centrifugation : Utilisation de laCytospin 4 Thermo Shandon
Programme N°3 : 800 T – 3 mn Cellules « fragiles « ( LCR liquide pleuraux riches )
Programme N°4 : 1000 T – 4mn Autres liquides et prélèvements fixés
ne se servir que de lames à adhésion renforcée (superfrost +)
 
Liquides d’épanchements : Cytospin 4 : Prendre 200 et 400 ml de liquide suivant l’aspect du liquide sans pré-centrifugation préalable, utiliser le programme 3 où 4 Fixer les lames en alcool éther ou à la laque
 
Lavages : Centrifugation classique : centrifuger au moins 4 gros tubes où la totalité du prélèvement si liquide peu riche puis faire 2 étalements où 2 cytospins suivant richesse du prélèvement et inclusion du culot restant
 
LCR  : Centrifuger le LCR au préalable, fixer le culot visible ou les 200 µl du fond du tube avec du sedfix où du Cytorich, puis prélever les 200 ml au-dessus du culot pour une où plusieurs cytospin. Utiliser le programme 3
 
Urines : Pré-centrifugation puis fixation au Sedfix ou Cytorich du culot et ensuite prélever 200 ou 400 µl pour cytospin
attention toujours tenir compte de la richesse macroscopique du culot rediluer si neccessaire
 
Thyroïde : centrifuger les prélèvements en flacon de Cytorich puis prendre 200µl en ayant éventuellement rediluer à l’œil le culot pour ne pas faire des cytospins illisibles. Utiliser le programme 4, minimum de 2 cytospins en faisant attention à la concentration cellulaire. Une des cytospins est fixée à la laque et colorée en Papanicolaou et l’autre conservée en alcool-éther pour une éventuelle coloration immunocytochimique. Si le matériel est suffisamment abondant on peut réaliser un culot de centrifugation destiné à être fixé en A.F.A pour une inclusion en paraffine
Les lames sèches sont colorées au MGG.
 
Kystes de sein et autres kystes : Même technique que les urines avec fixation au sedfix après première centrifugation si nécessaire
 
Aspiration bronchiques : Homogénéisez le prélèvement puis séparez le en 2
Mettre une moitié en cytorich à raison d’un vol d’échantillon pour 5 vol de cytorich agiter au vortex et laisser agir au moins 15 minutes .Faire ensuite selon la quantité du culot 2 étalements classiques où 2 cytospins avec les megafunnels sans post fixation Utiliser le programme 4
Centrifuger la seconde moitié et faire 2 étalements fixées ensuite à l’alcool éther.
 
Kystes pancréatiques : Le technicien peut aller sur les lieux du prélèvement pour étaler le matériel recueilli (lames sèches pour MGG). La totalité du prélèvement recueilli en flacon de Cytorich, est centrifugée. Des cytospins ou étalements classiques sont effectués en fonction de la densité cellulaire, fixés à la laque (minimum 2 en faisant attention à la concentration cellulaire) (1 Papanicolaou et 1 PAS), un culot de centrifugation est fixé en A.F.A pour inclusion en paraffine. Le surnageant est transmis en biochimie pour dosages complémentaires.
 
 
 
Coloration des lames
La coloration cytologique utilisée au laboratoire est la coloration de Papanicolaou .
Cette coloration est pratiqué dans une coloreuse de type Leica Autostainer XL.
La coloration de May-Grunwald Giemsa peut être parfois utilisé pour des ponctions ganglionnaires sans étiologie connue
Technique de la coloration de Papanicolaou
 
Réhydratation progressive alcool à 95° puis 70° puis 50° 10 mn
Rinçage à l'eau 5 mn
Hématoxyline de Harris 5 mn
Différentiation alcool acide 5 secondes 
Rinçage à l'eau 3mn
Déshydratation : alcool à 80° puis 95° 2 mn
OG6 (colorant alcoolique) 2 mn
Alcool à 95° (x2) 1 mn 
EA50 (brun Bismarck, éosine et vert brillant) 6 mn 
Alcool à 95° puis alcool absolu (x2) 3,30 mn
Toluène (x2) 1,30mn
Montage entre lame et lamelle avec la résine synthétique Entellan.
 
Screening cytologique : Le cytotechnicien vérifie les étalements avec les demandes d’examens puis procède à la lecture de la totalité de la surface des lames( screening) en inscrivant au dos du bon de demande son compte rendu cytologique et son hypothèse diagnostique. Il peut le cas échéant transmettre des demandes d’immuno-cytochimie notamment sur les cytologies de thyroïde ainsi que des demandes de colorations spéciales.
Il transmet ensuite les lames au médecin .accompagnées des demandes d’examens


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