» Laboratoire de pathologie Microdissection laser

Microdissection laser


La microdissection laser permet, sous contrôle de la vue et de l'expertise du pathologiste, de sélectionner une population ou une région cellulaire d'intérêt sur tous types de prélèvements tissulaires er répond au problème posé par l'hétérogénéité tumorale. Tout tissu biologique au microscope présente souvent une hétérogénéité cellulaire, cela est encore plus le cas en ce qui concerne les tumeurs. Ilest nécessaire de s'affranchir de cette hétérogénéité lorsque l'on souhaite faire porter l'analyse sur un échantillon de tissu homogène, ne contenant par exemple que des cellules tumorales, ou à l'inverse que des cellules du stroma de la tumeur,
Depuis 1996, la microdissection laser récupère les cellules d'intérêt sélectionnées sous contrôle microscopique à partir d'une coupe tissulaire en vue d'analyses moléculaires (échantillons de grande pureté sans risques de contamination par des cellules voisines dans des analyses de biologie moléculaire), cet outil a permis de diminuer la quantité de matériel prélevé tout en améliorant la qualité nécessaire pour réaliser des analyses plus pointues et reproductibles.
Lors de la microdissection tissulaire manuelle, assistée ou non par micromanipulateur, on gratte sous contrôle microscopique avec une pointe effilée une région d'une coupe tissulaire. L'utilisation d'un faisceau laser accroît la précision de la collecte, l'informatisation quasi complète du processus (de l'observation à la récupération de fragments) a favorisé son développement. Des colorations standards peuvent être utilisées si l'objectif est l'amplification de l'ADN, mais précaution et test préalable si on étudie les ARN / protéines. On peut utiliser l’immunohistochimie, voire l'immunofluorescence pour sensibiliser la mise en évidence de cellules d'identification morphologique difficile, ou peu nombreuses (techniques rapides en limitant les étapes pour éviter la dégradation des produits biologiques, dits" produits dérivés" (ADN, ARN et protéines).
 
Un microdissecteur laser est un microscope (droit ou inversé) couplé à un faisceau laser (infrarouge ou UV), de gestion informatique. Grâce à une une caméra, à différents grossissements, une ou plusieurs zones sont sélectionnées sur l'écran de l'ordinateur à l'aide d'un assistant graphique, qui sont ensuite découpés par un faisceau laser avec une précision de l'ordre du micron pour être récupérées dans un tube classique (tube Eppendorf®) ou sur un support particulier (capsule ou tube spécial) selon les appareils.
Dans le premier système LCM pour Laser Capture Microdissection (système PixCeli Ile®, et le système Veritas™ de Arcturus Engineering, Inc]. Le recueil des fragments se fait par adhérence sur un film thermosensible exposé à un laser infrarouge (IR) continu de basse énergie. Les capsules (CapSure™ HS, Arcturus Engineering) recouvertes de ce film sont placées au contact des zones d'intérêts sur la lame. Le microscope droit focalise le faisceau laser à travers la capsule pour faire fondre le film sur des cellules d'intérêts par une série d'impacts dans le périmètre d'une zone de diamètre préétabli (7,5 ; 15 ou 30 µ). Ces cellules adhèrent au film lorsque la capsule est soulevée de la coupe tissulaire et sont ensuite solubilisées dans le tampon approprié selon les protocoles envisagés (extraction, lyse, ... ) pour l'analyse des produits dérivés qui auront été extraits, La microdissection avec le Veritas™ combine dans un même instrument un laser IR et UV pour détruire des cellules potentiellement contaminantes ou une région tissulaire non souhaitée.
Le système LMPC pour Laser Microdissection and Pressure Catapulting (Carl Zeiss Microlmaging GmbH). est un microscope inversé + laser UV pulsé, de 355 nm, ce qui permet de travailler en dehors des longueurs d'onde d'absorbance des acides nucléiques / protéines. La coupe histologique est déposée directement sur une lame de verre, lavée et dégraissée, NON SuperFrost® qui sont à proscrire, puis recouverte d'une fine membrane (1,36 µ) sur toute la surface sauf au niveau d'un rectangle central où est déposée la coupe tissulaire. Le faisceau laser découpe la zone d'intérêt, qui par modification de l'énergie et défocalisation du plan d'action du faisceau laser, la zone découpée est catapultée vers le capuchon d'un tube classique contenant 15 à 25 µL d'un tampon approprié positionné à quelques millimètres à l'aplomb des cellules à récupérer qui vont venir s'y déposer.
Le Laser Microdissection System LMD (Leica Microsystems,), reprend le principe précédent d'un prélèvement sans contact direct avec modifications sur le mode de récupération du matériel. Le travail est effectué avec un microscope droit et la zone découpée par un laser UV est récupérée par gravité dans le capuchon d'un tube placé en dessous de la lame histologique. Dans ce système, à l'instar des autres, c'est le faisceau laser qui se déplace sur la zone à découper alors que la coupe tissulaire reste en place sur la platine du microscope.
Le MMi Cellcut®, proposé en France par Nikon, fonctionne avec un laser UV diode avec un microscope inversé. Les tubes de récupération (Isolation Cap®) ont une partie adhésive emplissant le capuchon. La coupe histologique est déposée sur une fine membrane insérée au centre d'une lame de verre ou de métal. Après coloration si nécessaire, le capuchon d'un de ces tubes va ensuite être mis en contact au recto de cette membrane (donc à l'opposé de la surface sur laquelle se trouve la coupe histologique). La zone d'intérêt est virtuellement délimitée, puis découpée par le laser avant d'écarter mécaniquement le tube de la membrane : les régions ou cellules alors précédemment sélectionnées restent ainsi fixées sur le capuchon et peuvent être ensuite analysées après solubilisation dans une solution appropriée.
Le but est d’augmenter la sensibilité / spécificité des analyses de biologie moléculaire et de comparer des zones différentes au sein d'une même tumeur.
Le résultat des analyses moléculaires après microdissection dépend non seulement du type tissulaire mais surtout de la qualité et de la préparation des échantillons.
Les coupes de tissu, congelé ou fixé puis inclus en paraffine, ne devront être ni trop épaisses, ce qui gênerait l'observation microscopique, ni trop fines, ce qui réduirait d'autant la quantité de matériel obtenu. En pratique, on utilise des coupes de 7 à 10 µ. L'observation nécessite un certain temps d'adaptation du fait de l'absence de lamelle et de milieu de montage sur la coupe tissulaire. On recommande de préparer simultanément une coupe sériée colorée mise entre lame et lamelle pour faciliter l'identification des zones ou cellules d'intérêt.
L'idéal est de disposer de matériel congelé (meilleure qualité de préservation tissulaire poiur l’analyse moléculaire). Le matériel inclus en paraffine, peut modifier /altérer les molécules Il faut travailler avec des gants (pour ne pas introduire de RNases, ni de kératines dans les milieux réactionnels) en utilisant des instruments réservés à cet usage (rasoirs, pinces, ... ), correctement nettoyés et stérilisés de manière à éviter les contaminations, voire de matériel stérile à usage unique. Les lames histologiques doivent être propres et traitées préalablement par une solution de diéthylpyrocarbonate (DEPC en solution à 0,1 % dans de l'eau) avant stérilisation pour limiter la dégradation de l'ARN. Il doit en être de même des solutions utilisées tout au long d'un protocole qui auront été préparées avec une eau stérile également traitée avant d'être autoclavées.
Tissus congelés : La qualité du prélèvement initial est essentielle. Influence de l'ischémie chaude (temps écoulé, entre le clampage vasculaire et l'excision) sur la dégradation des ARN (baisse de 50 % des ARN de haut PM dans les reins après une heure d’ischémie chaude). Elle entraîne la nécrose cellulaire rapide, et ne doit pas dépasser quelques minutes. La réfrigération protège les organes contre l'ischémie chaude. Eviter tout contact du tissu avec un composant chimique utilisé pour congeler les tissus comme l'isopentane ou l'OCT (pour optimal cutting temperature, aussi appelé Tissue-Tek® embedding medium, Sakura Finetek) qui interfère avec l'analyse moléculaire. Dans l'idéal : congélation rapide par azote liquide en immersion totale sans contact direct des échantillons autre que les vapeurs au travers d'un cryotube dans lequel ils ont été placés dans des conditions stériles (en condition RNase-free), puis stockés à - 80 °C en congélateur sous surveillance afin de ne pas rompre la chaîne du froid. Afin d'éviter la dégradation des ARN par l'activation des nucléases tissulaires présentes en quantité variable d'un tissu à l'autre, la chaîne du froid doit être maintenue jusqu'à la préparation des coupes au cryostat. De fait, les coupes doivent être bien déshydratées et la microdissection doit être réalisée rapidement, dans une échelle de temps allant de 15 à 20 minutes par coupe histologique, avant que l'activation des RNases tissulaires maintenues à température ambiante pendant la microdissection ne dégrade trop les ARN.
Tissus fixés : La fixation doit être rapide pour éviter l'altération des acides nucléiques et des protéines (entre 2 et 12 heures pour des petits fragments), la surfixation diminue le rendement d'extraction des acides nucléiques. Le formol /dérivés, induit des agrégations entre protéines par formation de base de Schiff et de ponts méthylènes, pour éviter la transformation en acide formique, le pH doit être tamponné avant utilisation. Alors que l’extraction de l'ADN est possible, l'étude des ARN à partir de tissu fixé est à éviter, les traitements appliqués altèrent les structures protéiques (la paraffine chauffée à 56 °C sur 10 heures pour permettre une imprégnation correcte des tissus, perturbe la réactivité immunohistochimique de certaines protéines). Le liquide de Bouin aqueux ou alcoolique est prohibé en biologie moléculaire.
La coloration histologique avec microdissection, interactions / dégradations selon le colorant employé. L'héma­toxyline est utilisée avec l'éosine, mais cette dernière seule peut se révéler utile par sa capacité à fluorescer. C'est l'expérience et/ou une mise au point préa­lable par des tests qui guident l'expérimentateur. Des fabricants de microdissecteur (système Navigator® sur le système LMPC de PALM) utilisent un système de repérage informatisé au travers duquel, à partir de coupes histologiques sériées, une coupe est colorée entre lame et lamelle et sert de référence pour les autres lames qui, non colorées, seront microdisséquées. Dans quelques cas, notamment pour des tissus riches en protéases, il peut être conseillé d'ajouter à la solution de colorant un mélange d'inhibiteurs de protéases tels ceux disponibles chez certains fournisseurs de réactifs biologiques.


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