» Laboratoire de pathologie Mutation de Kras

Mutation de Kras


Mutations du gène K-RAS : KRAS est un proto-oncogène humain homologue d'un oncogène viral (gène transformant) isolé à partir du "Kirsten RAt Sarcoma virus", situé en 12p12.1 codant une protéine de 21 kD de type" GDP-GTP bin­ding" qui est 1effecteur sur de nombreuses voies de transduction du signal comme la voie de l’EGFR.
Présence de mutations somati­ques de l'oncogène KRAS dans de nombreuses tumeurs dont 35 à 40 % des cancers colorectaux, avec modification de la conformation de la protéine mutée qui stabilise la liaison de KRAS au GTP, ce qui active la voie de transduction située en aval. Des signaux de mobilité cellulaire, de croissance cellulaire, d'angiogenèse et anti­apoptotiques sont alors produits par la cellule néoplasi­que porteuse de cette mutation (ce qui définit bien le rôle oncogénique du gène KRAS muté). Les mutations de KRAS touchent essentiellement les codons 12 et 13 de l'exon 2 (c.34G, c.35G du codon 12 et c.37G, c.38G du codon 13). D'autres mutations moins fréquentes sont décrites en particulier celles qui sont situées au niveau des codons 59, 61, 63 et 146.
La présence de mutations de KRAS prédit l'absence de réponse aux thérapies ciblées anti-EGFR (erbitux) dans les CCR, ces mutations rendent la tumeur insensible à un blocage en amont par 1 Ac qui interrompt la voie de transduction du signal en empêchant la fixation du ligand EGF sur son récepteur EGFR. L’AMM du panitumubab (Vectibix â) et du cetuximab (Erbitux â) précisent, depuis l'été 2008, la néces­sité de rechercher les mutations du gène KRAS avant de prescrire ces molécules sur 1 CCR métastatique. Une mutation du gène BRAF a lemême effet de résis­tance aux traitements par Ac monoclonaux anti-EGFR, ce gène (v-raf murine sarcoma viral oncogene homologB1), est localisé en 7q34 et code une sérine­thréonine kinase intervenant dans la cascade de transduction du signal. Dans environ 6 % des CCR, mutation activatrice dans l'exon 15 (c.1799T>A, p. V600E) avec activation constitutive de BRAF, d’où rôle oncogénique puissant.
Les mutations de KRAS sont très précoces dans la cancérogenèse colorectale (cryptes aberrantes) et restent présentes et identiques lors de la progression tumo­rale.
Une étape pré-analytique d'extraction de l'ADN génomique à partir du tissu tumoral fixé et inclus en paraffine est un pré-re­quis aux techniques de recherche de mutations de KRAS. Contrôle morphologique du pathologiste qui vérifie la cellularité tumorale dans l'échantillon (>20 à 30 % de cellules tumorales pour que le test soit valide). Après vérification de la qualité de l’ADN extrait, les mutations de KRAS sont analysées par différentes techniques de biologie moléculaire : amplification de la région d'intérêt par PCR en temps réel, analyse des produits d'amplification par séquençage, pyroséquençage ou extension à partir d'amorces spécifiques des nucléotides 34G, c.35G, c.37G et c.38G.
La réaction d'extension d'amorces est réalisée à partir des produits d'amplification des exons 2 de KRAS, 15 de BRAF selon la technologie SNaPshot®.
Le principe de cette méthode est basée sur l'extension d'amorces avec des désoxyribonucléotides ddNTPs fluorescents à partir d'amorces hybridées par leur extrémité 3' sur les nucléotides précédant les 5 nucléotides d'intérêt K-:RAS c. 34 , c.35, c.37 et c.38 et BRAF c.1799). Les quatre ddNTPs (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTIP), mar­qués par quatre fluorophores permettant leur détection sont complémentaires des nucléotides étudiés : ils provoquent l'arrêt de l'élongation lorsqu'ils sont incorp­orés. Les amorces comportent aux extrémités 5' des oligonucléotides de taille variable et non complémentaires du génome humain qui permettent de les distinguer et de les utiliser simultanément. Pour un échantillon, deux réactions d’extension d'amorces sont réalisées : une à partir des amorces s'hybridant sur le brin sens en 5' des positions d'intérêt et une seconde à partir des amorces s'hybridant sur le brin antisens. Cette analyse des brins sens et antisens permet de contrôler les résultats et de garantir la reproductivité de la méthode. Les amorces étendues sont séparées sur un séquenceur automatique d'ADN et les résultats analysés à l'aide d’un logiciel GeneMapper. La présence d'une mutation hétérozygote se traduit par la détection pour une position étudiée de deux ddNTPs incorporés : l'un complémentaire du nucléotide sauvage et l'autre du nucléotide muté. Des mutations artéfactuelles ayant été décrites pour des prélèvements fixés au formol et inclus en paraffine, deux analyses indépendantes sont réalisées pour conclure à la présence d'une mutation du gène KRAS. Les étapes pré­analytique et analytique sont ensuite validées lors de réunion pluridisciplinaire en présence d'un pathologiste et d'un bio­logiste moléculaire qui cosignent les comptes rendus.


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