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Données récentes sur la production d’anticorps monoclonaux à visée diagnostique en histopathologie


Données récentes sur la production d’anticorps monoclonaux à visée diagnostique en histopathologie
La production d'Ac monoclonaux a été obtenue pour la première fois par Milstein et Kahler dans les années 1975. Elle résulte de la fusion de lymphocytes B de souris immunisées et de cellules myélomateuses murines et condui­t à la génération d'hybrides cellulaires produisant un anticorps monoclonal spécifique de l'immunogène. On peut recourir à des techniques de biologie moléculaire à partir des ADN complémentaires (ADNc) codant les régions variables des chaînes lourdes et légères de l'hybridome, afin de produire les anticorps monoclonaux par génie génétique.
Chez l'homme, on observe 5 classes d'immunoglobu­lines (Ig), A, D, E, G et M. La structure de l' IgG sert de référence structu­rale, elle comporte 2 chaînes lourdes identiques (H) d'environ 50 kDa et 2 chaînes légères identiques (L = k ou λ d'environ 25 kDa). Chacune des chaînes est organisée en domaines d'une centaine d'acides aminés, deux pour les chaînes légères (VL et CL) et quatre pour les chaînes lourdes (VH, CH1, CH2, et CH3). Les domaines VL et VH sont les domaines variables qui fixent l'antigène. Chaque domaine variable possède trois boucles hypervariables qui constituent le site de spécificité antigénique. Les domaines CL, CH1, CH2 et CH3 sont appelés domaines constants. Chaque domaine comporte un pont disulfure (intra-brin). La chaîne légère est liée à la chaîne lourde par un pont disulfure localisé aux extrémités C-terminales des domaines CL et CH1. Les chaînes lourdes sont liées entre elles par des ponts disulfures localisés au niveau de leur région charnière (H). Chez la plupart des mammifères, le fragment CH2 est glycosylé.
 
La production d'Ac polyclonaux se fait par l'immu­nisation d'un animal, avec un antigène, on récu­père dans leurs sérums un cocktail d'Ig avec 5 à 10 % d'Ac dirigés contre l'Ag utilisé pour l'immunisation (antisérum). Ce type d'Ac facile à obtenir pose des problèmes de sensibilité et de spécificité. Les techniques d'hybridome répondent avec souplesse au problème de la produc­tion continue de ces Ac.
 
Anticorps monoclonaux murins : des lymphocytes B (le plus souvent issus de splénocytes) d'un animal immunisé sont fusionnés in vitro avec un agent de fusion membranaire (polyéthylène glycol) à des cellules de myélome murin, déficientes en HGPRT (enzyme de l'étape alterne de néosynthèse des nucléotides). Par culture dans un milieu contenant l'ami­noptérine (bloque voie de synthèse de nucléotides), on sélectionne les cellules myélomateuses ayant acquis par fusion la voie HPRT. On peut immuniser par cellules entières ou protéines recombinantes / peptides de synthèse avec adjuvant dit de Freund (meilleure sti­mulation immunitaire). La production d'anticorps en grande quantité est obte­nue grâce à une mise en culture des hybridomes dans des incubateurs (cytoculteurs). Le prélèvement de sur­nageant permet, après purification, d'obtenir l'anticorps d'intérêt en quantité titrable. Des techniques historiques, aujourd'hui interdites, consistaient à transplanter l'hybri­dome dans le péritoine d'une souris de manière à obtenir une ascite. Les prélèvements d'ascite contenaient une très forte concentration d'anticorps sécrétés par les cellules hybrides.
 
Anticorps monoclonaux de lapin
Depuis la découverte d’un partenaire de fusion (myélome d'espèce) il y a 15 ans on obtient des Ac monoclonaux, de forte spécificité et affinité pour l'Ag.
 
Une fois l'hybridome obtenu, on peut chercher 1 objectif thérapeutique. On cherche à éviter leur rejet immunologique, en créant un Ac chimère (on clone avec des séquences codant pour les régions constantes des mêmes chaînes mais de nature humaine). Ces anticorps chimères sont de la famille -XIMAB, le plus connu étant le Rituximab (anti-CD20/Mabthera).
On greffe par technologie d'ADN recombinant, les régions hypervariables d'Ac monoclonaux de souris sur des régions dites de charpente des gènes d'Ig humaines (on greffe les régions murines spécifiques de l'Ag sur les régions charpentes d'Ig humaine). Cela limite la part murine de l'Ac aux régions spécifiques à l'Ag = Ac de la famille [-ZUMAB avec par exemple l'anti-HER2 (Trastuzumab/Herceptine)]
On clone les régions variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère de l'Ig d'intérêt pour former un Ac de type simple chaîne, qu’on fait exprimer à l'extrémité de filaments de bactériophages (technique de phage display). Le variant simple chaîne va permettre au phage de se lier à l'antigène spécifique sur un support solide (type ELISA).
Enfin, la dernière technique d'humanisation d'anticorps monoclonaux est l'utilisation de souris transgéniques On remplace les gènes codant pour les Ig murines par les gènes codant pour les Ig humaines et à immuniser l'animal avec l'Ag ou la protéine d'intérêt. Cette technique permet d'obtenir les anticorps 100 % humanisés. Ces animaux sont disponibles commercialement et plusieurs firmes pro­posent des souris avec un répertoire entièrement humanisé[XenoMouse (Abgenix), HuMAB (Medarex) mouse].
 
On peut marquer des Ac anti-tumeurs par des radio-isotopes (immunoscintigraphie, radio-immunothérapie), mais peu utilisé.
 
NB : les animaux de la famille des camélidés (lamas, chameaux ... ) produisent 2 types d'anticorps : les Ac à 4 chaînes et des Ac plus petits à 2 chaînes (le fragment qui reconnaît et s'attache aux Ag correspond à 1 domaine uni­que), ils sont plus résistants à la chaleur et aux enzymes digestifs et sont faciles à fabriquer (produits avec des levures / bactéries. Il existe aujourd'hui énormément de banques de clones de ce type d'anticorps. Leur utilisation pour le diagnostic histo­pathologique reste hypothétique mais leurs propriétés physico-chimiques (résistance, petite taille, traversée possible de la barrière hémato-encéphalique) les rendent intéressants en thérapeutique.


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