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Biobanques et plateformes moléculaires en France


Examens moléculaires  : ACP et plateformes moléculaires

Certains biomarqueurs moléculaires sont complémentaires pour le diagnostic, classification, choix et surveillance du traitement d’un nombre croissant de cancers. Le choix de la stratégie thérapeutique repose dans certains cas uniquement sur le type histologique et le stade de la maladie. La détermination de ces marqueurs moléculaires peut être du ressort de l’immunohistochimie en ACP (RE/RP, her2 dans le cancer du sein) ou de la biologie moléculaire via les ’plateformes’ de génétique moléculaire des cancers (mutation de EGFR, K ras et B RAF). Les thérapies ciblées sont aujourd’hui disponibles pour plusieurs localisations tumorales (en oncohématologie et dans les tumeurs solides), dont certaines très fréquentes, parmi lesquelles le cancer du sein, le cancer du poumon et le cancer colorectal. Il est ainsi nécessaire de fournir un accès aux tests compagnons à un grand nombre de patients, tout en respectant des conditions de qualité optimales et des délais de rendu des résultats compatibles avec la prise en charge des patients.

Les tests de génétique moléculaire des cancers sont peu standardisés, tant en termes de techniques que sur le plan des altérations à rechercher.

La liste des biomarqueurs à rechercher en pratique clinique est amenée à croître régulièrement de par le nombre croissant de thérapies ciblées en cours de développement dans des populations de patients définies par les caractéristiques moléculaires de leur tumeur.

Pour répondre à ce besoin sanitaire, l’INCa a mis en place dès 2006, en collaboration avec la DGOS, un programme de structuration de la génétique moléculaire avec 28 ’plateformes’ hospitalières publiques de génétique moléculaire des cancers, réparties sur l’ensemble du territoire, qui réalisent les tests moléculaires innovants pour tous les patients de la région, quel que soit l’établissement où ils sont pris en charge (CHU, CLCC, CH ou établissement privé).

En dehors des tests prédictifs (Kiras, EGFR) ; elles effectuent des tests diagnostiques (mutations de JAK2 dans les syndromes myéloprolifératifs), à visée pronostique (amplification de NMYC dans les neuroblastomes) ou de suivi de la maladie résiduelle (quantification du transcrit BCR-ABL dans les LMC).

 

L’évaluation par la pathologiste du % de tumeur est sujet à d’importantes variations d’évaluation par différents pathologistes Mod Pathol. 2014 Feb ;27(2):168-74, ce qui à mon avis ne modifie en rien la nécessité d’effectuer cette évaluation. En effet cette étude n’aborde pas la problématique de l’analyse en biologie moléculaire qui est elle même une interprétation faite par un biologiste avec des outils informatiques, ni de la pertinence de ces résultats. Que signifie la présence d’une mutation autorisant / interdisant une thérapie ciblée ?

Si le prélèvement est considéré non significatif, cela peut correspondre à de rares cellules tumorales non présentes / non vues sur le plan de coupe examiné par le pathologiste ou correspondre à une fausse positivité de la biologie moléculaire qui n’est à l’instar de l’anatomie pathologique pas une panacée.

On ne doit pas sous prétexte d’abord difficile à la tumeur ou sa métatase s’affranchir de la nécessité d’un prélèvement significatif pour affirmer un diagnostic avant de se lancer dans un traitement couteux avec des efftes secondaires significatifs, pour des raisons simples de déontologie médicale.

 

Les tumorothèques ont une double vocation : la conservation à visée sanitaire pour une prise en charge optimale du patient, et la conservation à visée scientifique de ressources biologiques destinées à être à la disposition de projets de recherche en cancérologie.

L’ccès à une tumorothèque est inscrit dans le dispositif d’autorisation des établissements de santé pour le traitement du cancer. Le cinquième critère d’agrément pour la pratique de la chirurgie des cancers stipule en effet qu’en cas de besoin pour la prise en charge d’un malade, l’accès à une tumorothèque doit être organisé sur place ou garanti par une convention, selon les recommandations de conservation des prélèvements définies par l’Institut National du Cancer..

Conservation et utilisation des échantillons tumoraux en cancérologie- Actualisation 2011 des indications et recommandations aux tumorothèques- document disponible sur www.e-cancer.fr

Les biobanques en France  : enjeux et contraintes

Les tumorothèques sont des banques d’échantillons cellulaires et/ou tissulaires congelés assortis d’annotations biologiques, anatomopathologiques et cliniques dynamiques.

Elles ont une double finalité : d’une part, permettre la réalisation d’analyses nécessitant la mise à disposition d’échantillons congelés dans une démarche de soins et, d’autre part, permettre la mise en œuvre de projets de recherche à partir d’échantillons biologiques.

Les projets de recherche, intégrant l’utilisation d’échantillons cryopréservés, nécessitent la mise à disposition, par les tumorothèques, des annotations qui correspondent à des informations structurées.

Elles se sont développées autour de l’activité médicale pour collecter et conserver des échantillons tissulaires et cellulaires permettant d’établir le diagnostic et le pronostic des tumeurs, dans un contexte d’activité de soins (seule justification acceptable de procédures invasives de prélèvement) avec rôle prépondérant des pathologistes. Elles se sont développées grâce au soutien à partir de 2001 de la Direction hospitalière de l’organisation des soins (DHOS), l’INCa, l’Inserm, l’Agence nationale de la recherche (ANR), et le GIS IBISa (Infrastructures en biologie santé et agronomie).

Ce matériel biologique représente une source d’études scientifiques à l’ère des analyses moléculaires à haut débit et donc rôle dans la recherche clinique et translationnelle en oncologie. Néanmoins, cette recherche a des exigences, le pathologiste reste en 1ère ligne car il faut congeler sans pénaliser le diagnostic, mais nécessité d’informations administratives et médicales anonymisées (dynamiques car procédures d’actualisation, ce qui exige une interface entre l’informatique de la biobanque et le système d’information des établissements de soins, qui sont tous différents s’ils existent (loin d’être acquis) et l’interconnection entre les systèmes informatiques des différentes biobanques (même problème de faisabilité et de prix)), nécessité d’une information relative à l’existence de la tumorothèque, recueil de l’accord du patient (consentement éclairé signé par le patient et par le médecin préleveur, en cas de recherche génétique à partir de produits congelés consentement spécifique mentionnant une telle recherche), cellules sanguines, plasma, sérum, source d’ADN constitutionnel, faisant intervenir d’autres acteurs, cliniciens, chirurgiens, biologistes, personnels infirmiers et administratifs, qui doivent être coordonnés. Nécessité d’organiser les relations tumorothèque - utilisateurs sollicitant un accès aux échantillons. Les tumorothèques sont un exemple particulier de Centres de ressources biologiques (CRB) (qui collectent des échantillons de maladie néoplasique, inflammatoire, infectieuse, = mission scientifique), avec collecte de matériel tumoral non réplicable dans le cadre des soins (mission sanitaire), qui limite la taille des collections. Les tumorothèques peuvent s’organiser en réseaux permettant de mettre en commun leurs ressources (harmonisation des pratiques de biobanking, optimisation de la qualité des annotations cliniques associées aux échantillons, en sensibilisant les responsables des tumorothèques) (par ex : exportation de l’ensemble des données sur un site consultable en ligne par les utilisateurs potentiels des collections à des fins de recherche). Création d’un maillage territorial pour des pathologies ciblées, entrant dans un cadre sanitaire (sarcomes, tumeurs pédiatriques, tumeurs cérébrales, lymphome / ­myélome, adénocarcinomes pulmonaires, et adénocarcinomes coliques du sujet jeune).

Historiquement certaines biobanques ont été créées dans un but spécifique (ex : essai clinique), les biobanques à vocation épidémiologique suivent longtemps de grandes populations (100000 à 500 000 personnes) pour surveiller le développement naturel et/ou la progression de différentes maladies, les échantillons étant obtenus de façon peu invasive (ponction veineuse, écouvillonnage, recueil d’urine).

Il est conseillé, voire quasi obligatoire, de garantir par exemple que les échantillons cédés pour la recherche proviennent de patients séronégatifs pour le virus de l’immunodéficience humaine et pour les virus des hépatites B et C.

Difficulté liée à l’assurance qualité et les contraintes imposées pour préparer une démarche de certification ou d’accréditation. Ceci implique que toutes les tumorothèques puissent bénéficier de la présence à temps plein d’ingénieurs qualité et d’une enveloppe financière dédiée et pérenne (ceci garantit les moyens mais pas obligatoirement la qualité du matériel, car on n’a parfois aucun contrôle de la phase avant congélation, les pièces opératoires mettant parfois beaucoup de temps pour arriver au service d’anatomie pathologique y compris lorsqu’il existe une proximité entre la chirurgie et l’anatomie pathologique).

Le concept de tumorothèque virtuelle, reliée aux tumorothèques locales par un système d’information permet une connaissance à jour des ressources biologiques disponibles à l’échelon d’un cancéropôle.

Une liste d’informations, correspondant à des critères minimaux de description des échantillons, constitue la base d’un catalogue commun informatisé. Ce catalogue est testé et adapté au travers des Programmes nationaux d’excellence spécialisée et peut être inclus dans le cahier des charges local du système d’information de la tumorothèque ou permettre le paramétrage du système existant.

Le catalogue national n’a en lui même qu’un intérêt scientifique limité dans la mesure où la plupart des annotations cliniques, biologiques ou histopronostiques ne sont pas incluses dans la liste. Néanmoins, les utilisateurs potentiels peuvent ainsi être informés des ressources biologiques disponibles, via une requête informatique réalisée à l’échelon du cancéropôle. Ils contactent secondairement les responsables locaux des tumorothèques et s’informent des conditions locales d’accès aux échantillons.

La maîtrise de la cession des échantillons biologiques doit en effet rester une prérogative des tumorothèques locales et des établissements selon une politique scientifique de site qui s’appuie sur les décisions d’un comité scientifique dans lequel le cancéropôle et la direction des établissements sont représentés.

http://eurocancer.jle.com/articles/2008/25.htm

Tumorothéques  : Les conditions de prélèvement se répercutent sur la qualité et l’utilisation potentielle des échantillons (respect des consignes propres à chaque type de prélèvement). Sont recueillies des informations telles que : nature de l’échantillon (sang, ascite, urine, LCR etc...), site de recueil (artère ou veine, urines émises ou sondage, etc.), modalités de recueil, matériel (récipient, etc.) et les additifs éventuels (anticoagulants (acide éthylène diamine tétracétique (EDTA-K3), pas d’héparine (inhibition des ADN polymérases en PCR), sauf si mise en culture prévue (cytogénétique)), antiseptiques, etc.).

La préparation des liquides fait appel à des méthodes physiques dont les modalités sont précisées (centrifugation, sédimentation, etc.) ou chimiques (acidification, digestion, etc.), parfois complétées par une purification moléculaire partielle ou totale (isolement de lipoprotéines, séparation de classes de protéines, etc.).

Analyse d’ARN : préconisations suivantes : rapidité de congélation, port de gants, utilisation de matériel sans nucléases.

Une fiche de transmission accompagne chaque échantillon, dont l’identification pérenne est assurée et précise : l’identité du patient, identité / coordonnées des opérateurs (préleveur, transporteur, destinataire), la préparation éventuelle avant le transfert au laboratoire (séparation, fractionnement, type de conditionnement, etc), les conditions de transport : manuporté, pneumatique, température, etc. Les délais d’acheminement : date et heure de prélèvement, de départ, de réception, les éventuelles non-conformités à cette étape du processus.

Au laboratoire, une personne qualifiée et identifiée reçoit ces échantillons, contrôle la conformité aux exigences préétablies, note les éventuelles non-conformités et réalise l’enregistrement, en précisant la date et l’heure de réception et l’état du prélèvement.

Le conditionnement des prélèvements est fait par du personnel formé avec un nombre minimum d’intervenants, dans des tubes / sachets adaptés à la cryogénie, qui ferment hermétiquement et résistent à – 196 °C. Pour les culots et suspensions cellulaires, le nombre de cellules dans chaque tube doit être connu, ainsi que la composition du milieu de suspension ou du liquide de conservation et le caractère stérile ou non du prélèvement.

L’addition ou non d’un milieu d’enrobage et l’utilisation de procédures stériles pour la préparation des échantillons doivent être connues.

Congélation rapide par immersion du tube / sachet dans un fluide réfrigérant (l’isopentane refroidi par l’azote liquide). La chaîne du froid ne doit pas être rompue jusqu’à l’utilisation finale du prélèvement.

Pour les analyses qui nécessitent une étape de mise en culture, les procédures de congélation doivent préserver la viabilité des cellules, avec notamment une vitesse de descente en température maîtrisée.

Les échantillons de sang / moelle en EDTA sont congelés en moins de 24 h (entretemps ils sont conservés entre 15 et 25 °C). Lorsque les délais sont plus longs, utiliser le RNA later.

Conservation des prélèvements : l’idéal est la conservation en azote liquide, sinon impérativement en dessous de – 70 °C car les ribonucléases (RNAses) sont actives aux températures à plus de – 70 °C.

Les appareils de conservation de la tumorothèque doivent être placés dans des locaux fermant à clé, avec climatisation et systèmes d’alarme efficaces, garantissant le maintien des températures requises. L’accès aux locaux / collections est réglementé et réservé à des personnes habilitées et formées. Les appareillages sont régulièrement entretenus, dégivrés, et le bon fonctionnement des alarmes est testé.

Le contrôle des températures est assuré en continu, enregistré, vérifié et les documents d’enregistrement conservés, afin d’assurer la traçabilité en continu de la chaîne du froid. L’ensemble des systèmes de froid et les dispositifs de mesure du froid font l’objet de contrôles métrologiques réguliers, dont les résultats sont archivés.

Un appareillage de secours doit être maintenu en état de marche afin de pouvoir recevoir des échantillons en cas de défaillance technique. Les procédures d’intervention d’urgence doivent être affichées à proximité des appareillages.

Pour les extractions d’acides nucléiques, la congélation en culot sec ou en liquide de lyse adapté à l’extraction est recommandée. La congélation de cellules isolées en suspension en solution cryoprotectrice (volume équivalent à l’aliquot) permet des applications telles l’immunophénotypage, culture cellulaire, extraction d’acides nucléiques. Avant d’aliquoter, il est recommandé d’évaluer la viabilité et le nombre des cellules.

La congélation directe du sang total est possible mais il est préférable de congeler un culot de leucocytes après lyse différentielle des globules rouges. Cette méthode de congélation ne peut être utilisée que pour préparer de l’ADN.

Conservation d’acides nucléiques

· ADN à + 4 °C pour utilisation immédiate, et à – 20 °C / – 80 ° C, éventuellement sous forme

précipitée, pour une utilisation à long terme.

· ARN : à – 80 °C, voire sous forme précipitée dans l’éthanol, à long terme.

La traçabilité est « l’ensemble des informations et mesures prises pour suivre et retrouver rapidement l’ensemble des étapes allant de l’examen clinique du donneur à l’utilisation de cet élément ou produit du corps humain, en passant par le prélèvement, la transformation, la conservation, le transport, la distribution ». Elle passe par la tenue de documents écrits ou numériques archivés : cahiers de laboratoires, modes opératoires, procédures.

Elle doit être assurée dans tous les cas, et particulièrement si prélèvements successifs pour un même patient, un même prélèvement fait l’objet de plusieurs analyses.

L’identification du prélèvement doit être faite sur le tube ou le sachet avec emploi de crayons ou étiquettes cryogéniques, codes à barres, data matrix ou radio-étiquettes). Une double identification du prélèvement est recommandée (numéro d’enregistrement au laboratoire et identifiant du patient). Il est recommandé de séparer prélèvements primaires et secondaires.

Décongélation des échantillons : suit un protocole de décongélation avec contrôle de qualité, qui peut inclure le dosage de molécules présentes dans l’échantillon biologique conservé, ou dans un échantillon d’un programme de contrôle de qualité interne conservé dans les mêmes conditions. S’il faut réaliser plusieurs cycles de congélation-décongélation, cette information doit être tracée et archivée.

Le transport d’échantillons doit respecter des règles qui assurent leur intégrité et la sécurité des personnels. Des indicateurs de qualité (durée de la transmission, respect de la chaîne du froid, etc.) sont mis en place. Une procédure de prévention des risques liés à la transmission d’agents infectieux véhiculés par le prélèvement (notamment sang ou liquides biologiques) est mise en place. La traçabilité des événements imprévus / indésirables est assurée.

Il est essentiel qu’aucune analyse ne soit réalisée sur un échantillon tissulaire sans contrôle microscopique préalable, s’assurant que l’échantillon comporte bien la lésion et que celle-ci n’est pas nécrosée (contrôle de l’anatomopathologiste sur coupe en miroir du prélèvement de tumorothéque ou contrôle morphologique avant l’extraction d’acides nucléiques).

 

L’exhaustivité, pertinence, exactitude des données cliniques, qualité des informations doivent être assurées tout au long du processus de recueil, acheminement, préparation, conditionnement et conservation des prélèvements. Ceci nécessite : la conformation aux dispositions légales concernant les données directement ou indirectement nominative traitées par informatique : des formalités doivent être accomplies auprès de la CNIL, l’information et le consentement du patient.

Il est recommandé que la base de données de la biothèque formate la saisie des informations (formats de champs prédéfinis, menus déroulants, etc.), avec formation initiale et continue des utilisateurs du logiciel, y compris lors de changements de versions, avec procédure permettant la maîtrise des accès (par ex mot de passe), les mises à jour et maintenances, la sauvegarde (support et périodicité spécifiés) et la restauration des données, ainsi que l’accès à des réseaux informatiques.

Renseignements sur la (les) pathologie(s) diagnostic principal et pathologies associées : code nomenclature ou nom de la pathologie initiale ou principale. Un résumé succinct de l’histoire de la maladie et de ses principales caractéristiques cliniques, biologiques ou autres, ainsi que des traitements antérieurs ou actuels pourra être joint ; date du diagnostic ( aaaammjj).

Identification du prélèvement  : les informations suivantes concernant l’identification du prélèvement sont indispensables : localisation précise de la collection au sein de l’établissement, identification du prélèvement (numéro, code d’identification ou numéro d’enregistrement au laboratoire), date du prélèvement au format « aaaammjj », heure du prélèvement : au format « hhmm ».

Type d’échantillon (tissus ou cellules), code d’organe, côté (droit ou gauche), code du type de prélèvement (B pour biopsie, O pour pièce opératoire, C pour prélèvement cellulaire), code lésionnel ADICAP ou CIM-10.

Particularités liées aux liquides biologiques . Informations indispensables : type d’échantillon (sang total, plasma, sérum, LCR, liquide de drainage, urines, salive, sueur), type du prélèvement codés : P pour ponction liquidienne (sang, LCR, liquide d’épanchement…), R pour recueil non invasif (urines, salive), D pour liquide de drainage, S pour recueil après stimulation (sueur, salive…).

Gestion des prélèvements : renseignements sur : nature et nombre des contenants (tubes en verre, pot en plastique), conditions et délai de transmission au laboratoire, température de transport : 37 °C, température ambiante, + 4 °C, - 20 °C et moins. Conditions particulières, le cas échéant : obscurité, etc, délai d’acheminement : < 1 h, < 2 h, > 2 h ou inconnu, conditions et délai de stockage, volumes des fractions aliquotes conservées, nombre, température de stockage : température ambiante, - 20 °C, - 80 °C, -140/150 °C, - 196 °C, heure du prélèvement : au format « hhmm », délai de mise en collection : < 1 h, < 4 h, > 4 h (le délai total avant congélation est à noter en minutes, sinon à calculer à partir de l’heure et minutes présumées du prélèvement, et de l’heure et minutes de la congélation) ou inconnu, méthode de congélation (température, par paliers ou en un temps ; stérile ou non ; milieu d’enrobage ou de conservation), conditions de transport, température de transport, délai de transport, modalités de l’acheminement (voie postale, transporteur, voie aérienne ou routière…).

Si les identifiants des échantillons extraits et de leurs produits dérivés sont différents, des liens doivent être conservés dans une base de données.

Particularités liées aux tissus Renseignements complémentaires : nombre de tubes avec du tissu pathologique, nombre de tubes avec tissu normal.

Pour les tumeurs, garder une partie du prélèvement tant que le malade est vivant.

Particularités liées aux cellules Renseignements complémentaires : · nombre total de cellules par tube pour les échantillons cellulaires, conditions de préparation : diméthylsulfoxyde (DMSO), culot, autre.

Particularités liées aux liquides biologiques Renseignements complémentaires : additifs lors du recueil : anticoagulant, antiprotéolytique, antiseptique, protecteur des macromolécules, fluidifiant, etc. avec sa (leur) dénomination (EDTA, ammonium quaternaire, etc.), conditions de préparation/transformation (centrifugation : température, vitesse, durée, additifs avant la conservation : fluidifiant, antiseptique, etc), purification partielle : précipitation, chromatographie, déprotéinisation chimique, etc.,

Dès la sortie des containers à azote liquide ou des congélateurs à – 80 °C, on transporte les échantillons dans un container adapté rempli d’azote liquide ou gazeux, ou de carboglace, pour garantir le respect de la chaîne du froid. Les biopsies / culots secs congelés sont lysés sans rupture de la chaîne du froid.

L’utilisation de coupes fines / broyage de fragments tissulaires est recommandé (contact rapide de l’échantillon avec le réactif de lyse pour optimiser le rendement d’extraction d’ARN). Lorsque le tissu a été préalablement enrobé d’optimal cutting compound (OCT), il faut limiter au maximum la quantité de ce dernier car il précipite avec l’éthanol avec colmatage des colonnes de silice, diminuant le rendement d’extraction.

La décongélation de cellules congelées en DMSO doit être rapide (on dilue la suspension cellulaire en milieu tamponné isotonique, en opérant tube par tube).

Extraction de l’ADN par méthode d’extraction au phénol chloroforme, sinon au perchlorate de sodium. Les techniques d’extraction utilisant l’affinité de l’ADN pour la silice sont recommandées pour les analyses par PCR en temps réel. Elles ne sont pas recommandées pour les applications nécessitant un ADN de haut poids moléculaire.

L’utilisation des RNases en cours d’extraction n’est recommandée qu’aux cas d’absolue

nécessité et avec les mesures de précaution adaptées.

Extraction des ARN : extraction au phénol acide : ARN totaux permettantdifférentes techniques (expression des gènes par Northern-blot  ; amplification par reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) ou RT-QPCR (quantitative) ; puces à ADN).

Extraction simultanée d’ADN et d’ARN  : des kits récents (fixation séquentielle d’acides nucléiques sur colonne de silice) permettent l’obtention parallèle d’ADN et d’ARN de bonne qualité (transcriptome sur puces à ADN ou amplification par PCR).

Pour les échantillons biologiques de très petite taille (ou tissus microdisséqués), il existe des kits d’extraction d’acides nucléiques adaptés aux microquantités (à partir du lysat cellulaire).

Après l’extraction, on évalue les acides nucléiques d’un point de vue quantitatif et qualitatif (spectrophotométrie / fluorimétrie dans un tampon plutôt que dans l’eau, concentration d’ADN qui doit être <200 ng/μl)

 
Sur une série de 614 cas testés en 2013 avec un panel de 50 gènes, taux d’échec de 74/14 = 12% passé à 5% l’année suivante, 90% des échecs sont liés à moins de 10ng de DNA (microprélèvements ou faible cellularité, bons résultats de l’ordre de 97% si exérèse ou 100% si T > 10 mm, 73% de bons résultats après décalcification Am J Clin Pathol. 2016 Feb ;145(2):222-37.



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