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Applications de l’immunohistochimie a la pathologie cutanée inflammatoire


Applications de l'immunohistochimie a la pathologie cutanée inflammatoire (1)
INTRODUCTION
Les techniques d'immunohistochimie ont une place privilégiée dans le diagnostic de certaines dermatoses inflammatoires : les maladies bulleuses auto-immunes (MBAI), le lupus érythémateux et les vascularites. Les premières se caractérisent par la production d'autoanticorps dirigés contre un constituant normal de la peau. Dans le lupus érythémateux et les vascularites, des complexes immuns sont fixés respectivement sur la jonction dermo-épidermique, et dans la paroi des vaisseaux.
Depuis la mise au point des techniques d'immunofluorescence (IF) par Coons, l'amélioration de la qualité des anticorps (Ac), les progrès des conditions de l'examen microscopique en lumière UV ont conduit à leur large diffusion. Toutefois, il est important de souligner que cet examen n'est qu'un complément de l'examen clinique et histopathologique. La valeur des résultats dépend du soin avec lequel le siège des prélèvements est choisi.
Les techniques immunoenzymatiques associées à la microscopie électronique ont permis de mieux classer les maladies bulleuses auto-immunes de la jonction dermoépidemique.
METHODES
Plusieurs types de prélèvements peuvent être examinés : cutanés et/ou muqueux. Savoir choisir le site du prélèvement est capital pour la fiabilité des résultats. Ce problème sera fonction de la pathologie et sera vu dans chaque indication. Les dépôts recherchés sont extracellulaires. Ils sont altérés ou masqués par la fixation formolée. Il est donc indispensable de réaliser toutes les réactions immunologiques sur des biopsies congelées, sans Fixation préalable, ou conservées dans le liquide de Michel.
A - Immunofluorescence cutanée directe et indirecte
L'IF directe permet de détecter les anticorps présents dans les biopsies des malades grâce à des anticorps anti-immunoglobulines humaines fabriqués par l'animal. En raison de la simplicité d'utilisation (une seule incubation, pas de temps de révélation, facilité de lecture) le marqueur le plus couramment utilisé pour visualiser la réaction est l'isothiocyanate de fluorescéine avec lequel est obtenu un conjugué stable. Si la peau contient un dépôt anormal d'immunoglobulines, sa nature et sa topographie peuvent être notées par un simple examen au microscope à lumière UV. La technique d'IF directe est réalisée sur des prélèvements frais, congelés dans l'azote liquide ou dans la carboglace sans fixation préalable. Néanmoins, si le laboratoire est éloigné, il est possible d'avoir recours à un fixateur spécial, le liquide de Michel, qui permet de conserver le prélèvement pendant 3 à 4 jours avant la congélation. Des coupes de 4 à 5 Il sont obtenues au cryostat. Les anticorps sont facilement disponibles dans le commerce. Leur qualité est homogène. Ce sont des anticorps polyclonaux de lapin ou de chèvre, conjugués (FITC). Les anticorps couramment utilisés sont les anticorps anti-IgA, anti-IgG, anti-IgM, anti-C3. Des précautions de stockage (conservation au froid à + 4'C, à l'abri de la lumière) sont indispensables. Tout nouveau lot doit être testé à sa réception sur un témoin positif. En cas d'utilisation peu fréquente, il est préférable de conserver à 30 'C des quantités fractionnées. Le tampon utilisé pour les rinçages et les dilutions des anticorps est le tampon monophosphate-bisodique (PBS) à pH 7,4. Il est important de surveiller le pH de la solution car une acidification du milieu entraînerait une élution des anticorps et une libération du fluorochrome. Elle se traduit par une augmentation du bruit de fond à la lecture des lames. Les lames doivent être soigneusement dégraissées pour éviter le décollement des coupes. Un passage dans une coloration de fond, telle le bleu Evans, améliore le contraste. Les coupes sont montées avec une gélatine spéciale pour IF, ce qui permet leur conservation pendant plusieurs mois à + 4 °C, à l'abri de la lumière. Les résultats sont qualitatifs. La topographie et la forme du dépôt sont les 2 éléments qui orientent le diagnostic. La réaction est notée comme positive ou négative avec chacun des anticorps utilisés. Aucune quantification objective ne peut être donnée. La comparaison de la positivité d'un anticorps à un autre chez un même patient peut être éventuellement formulée à l'aide de croix.
La présence anormale d'auto-anticorps sériques circulants se détecte in vitro. Cet examen est un test sérologique. Nous ne citerons ici que les principales caractéristiques. Le sérum du patient est incubé avec un substrat témoin : peau humaine de sujet sain ou tissu animal ayant des antigènes communs avec l'homme (œsophage de rat ou lèvre de lapin). La technique comporte deux temps, un premier temps d'incubation et un second temps de révélation, c'est la raison pour laquelle elle est désignée sous le terme d'IF indirecte par opposition à l'IF directe faite sur biopsie et qui ne comporte qu'un seul temps. Le résultat est qualitatif : topographie et forme du dépôt, et quantitatif : dernière dilution du sérum permettant d'obtenir un résultat positif.
B - Autres fluorochromes, doubles marquages
D'autres fluorochromes peuvent être utilisés, notamment la rhodamine. Elle est rarement utilisée seule en routine. La lecture est plus difficile qu'avec la fluorescéine, le contraste étant moins bon. Par contre, la rhodamine est souvent utilisée dans les doubles marquages. En effet, il est possible de détecter deux antigènes en utilisant des anticorps marqués par un fluorochrome différent. Ainsi, on peut appliquer successivement sur la même coupe un anti-collagène IV marqué à la rhodamine, et un anti-immunoglobuline humaine marqué à la fluorescéine. En peau décollée, c'est un procédé qui peut être théoriquement utilisé pour visualiser sur la même coupe le dépôt d'Ig et le collagène IV, constituant normal de la lame basale, mais la définition est souvent insuffisante pour permettre d'individualiser les 2 dépôts qui semblent superposés.
C - Techniques d'IF sur peau artificiellement décollée
La jonction dermo-épidermique est une structure complexe composée de plusieurs antigènes dont la localisation est connue en microscopie électronique. Au sein des maladies bulleuses auto-immunes se distinguent des sous-groupes caractérisés par des anticorps dirigés contre des antigènes différents de la jonction dermo-épidermique.
Lorsqu'une bulle est artificiellement provoquée en peau normale mécaniquement par succion ou chimiquement par l'action du sérum salé hypertonique, le clivage se produit dans la lamina lucida. Ainsi, la lamina lucida se trouve dans le toit du décollement et la lamina densa, dans le plancher. Si l'on incube le sérum d'un malade avec une peau témoin artificiellement décollée, l'on pourra déduire qu'il contient un anticorps dirigé contre la lamina lucida si le dépôt d'immunoglobulines ou de complément se situe dans le toit, et qu'il contient un anticorps dirigé contre la lamina densa ou contre la zone sous-basale, s'il se situe dans le plancher du clivage artificiel. Selon le siège de l'antigène ainsi déterminé, pourront être distinguées des maladies bulleuses auto-immunes dont l'aspect est identique en IF indirecte simple. Lorsqu'il n'y a pas d'anticorps circulants, la méthode indirecte ne peut être utilisée. Les mêmes résultats devraient être obtenus par IF directe sur bulle provoquée par trempage dans le sérum salé hypertonique d'une biopsie en peau juxta-lésionnelle chez le malade. Mais le clivage ne se situe pas toujours dans la lamina lucida chez un sujet dont la jonction dermo-épidermique est fragilisée par une pathologie bulleuse. Il faudra donc prendre la précaution de visualiser le collagène IV sur une coupe afin de s'assurer que la lame dense est dans le plancher de la bulle.
D - Utilisation d'un marqueur enzymatique
Avec les fluorochromes, il est nécessaire de lire les résultats au microscope à rayons UV, il est possible de les remplacer par un marqueur enzymatique, la peroxydase de raifort.
Cette méthode est plus longue et plus coûteuse mais elle présente 2 avantages
1) la réaction est lue en lumière photonique,
2) le marqueur mis en présence de son substrat, la diaminobenzidine (DAB)
donne un précipité opaque aux électrons. Il est donc possible de visualiser la réaction en microscopie électronique.
E - Immunomicroscopie électronique
Ils'agit d'une méthode précise mais présentant des difficultés de réalisation. Cependant la technique mise au point par Prost et coll. permet un passage en semi routine. Selon cette méthode, des tranches de tissu frais de 0,7 mm d'épaisseur sont incubées, après une préfixation par le paraformaldéhyde, dans des immuns sérums marqués par la peroxydase de raifort. La réaction antigène-anticorps est révélée par la DAB en présence d'eau oxygénée. Les tranches sont post-fixées Les coupes ultrafines ne sont pas colorées pour ne pas masquer le dépôt opaque aux électrons.
Grâce à l'immunomicroscopie électronique, le siège précis de la réaction antigène-anticorps peut être visualisé à l'échelle ultrastucturale, permettant de distinguer des variétés de maladies bulleuses auto-immunes dont l'antigène cible est différent.
F - Immunotransfert
Cette technique ne peut être appliquée qu'en présence d'anticorps circulants. Elle permet de déterminer le poids moléculaire des antigènes-cibles détectés spécifiquement par les anticorps circulants.
Indications en dermatologie inflammatoire
A - Les maladies bulleuses auto-immunes (MBAI)
L'IF directe est indispensable au diagnostic précis des maladies bulleuses autoimmunes. Des règles de prélèvement doivent être respectées. L'IF directe doit être faite en peau lésée juxta-bulleuse, jamais en pleine bulle pour éviter les altérations de la jonction dermo-épidermique observées en zone bulleuse et liées aux enzymes de l'inflammation. Elles peuvent être responsables de fausse négativité. Dans certains cas, il peut être utile de biopsier la peau ou la muqueuse saine. On distingue deux indications principales : les maladies bulleuses auto-immunes de la jonction dermoépidermique et les pemphigus.
Les maladies bulleuses auto-immunes de la jonction dermo-épiderinique sont caractérisées par la présence d'un anticorps dirigé contre l'un des antigènes de cette zone. Elles comprennent : le groupe des pemphigoïdes bulleuses (PB) : PB typiques, PB atypiques, PB cicatricielles, certaines dermatoses à IgA linéaire, herpès gestationis, épidermolyse bulleuse acquise (EBA). Toutes ces dermatoses se caractérisent par un dépôt linéaire d'IgG et/ou de C3 sur la jonction dermo-épidermique. Elles comportent inconstamment des anticorps circulants anti-membrane basale. Inversement, certains malades peuvent avoir des anticorps circulants sans être atteints de maladie bulleuse. Ainsi, l'IF indirecte n'est ni indispensable ni suffisante pour établir le diagnostic. Lorsqu'il y a des anticorps circulants, leur dosage peut être répété et constitue un critère de surveillance alors que la négativation de l'IF directe n'est pas constamment parallèle à l'amélioration clinique. Le groupe des dermatites herpétiformes (DH) qui comprenant la DH typique et certaines dermatoses à IgA linéaire, se caractérise par des dépôts d'IgA et/ou de C3 granuleux, fibrillaires et parfois linéaires situés sur la jonction dermoépidermique et /ou dans les papilles dermiques.
Toutes les variétés de pemphigus (P. vulgaire, P. séborrhéique, P. induits) ont en commun la présence d'anticorps anti-épiderme dirigés contre les desmosomes des kératinocytes. Ils réalisent un aspect en résille intra épidermique, caractéristique en IF directe et indirecte. Les anticorps fixés sont constamment trouvés en zone lésée, et sont aussi habituellement présents en zone saine, ce qui permet de faire le diagnostic par biopsie de muqueuse ou de peau saine en cas d'atteinte muqueuse exclusive dont les lésions sont difficiles à biopsier. Les anticorps circulants sont constants mais leur apparition peut être retardée par rapport au début des lésions. Les patients atteints de pemphigus superficiel ou paranéoplasique réagissent contre un antigène-cible différent de celui du pemphigus vulgaire.
B - Le lupus érythémateux et autres collagénoses
Les lupus érythémateux discoïdes sont localisés à la peau. L'IF directe est positive en peau lésée. Elle est négative en peau saine. Dans les lupus érythémateux aigus ou systémiques, elle est positive en peau lésée et en peau cliniquement normale, exposée à la lumière, notamment sur le dos du poignet. En zone couverte, elle n'est positive que dans 50 % des cas, les plus graves avec atteinte rénale. La positivité se traduit dans tous les cas, par un marquage de la jonction dermo-épidermique qui est soulignée par une bande continue, granuleuse, plus ou moins épaisse selon l'intensité de la positivité. Les dépôts les plus caractéristiques sont. composés d'IgG et souvent d'IgM accompagnés de complément (fraction C3 et/ou CIQ). Dans les lupus discoïdes, l'IF directe peut être négative dans les deux premiers mois d'apparition des lésions, ou après une corticothérapie locale prolongée.
Dans les autres collagénoses, l'IF directe n'a qu'une indication très limitée. Un marquage de la jonction dermo-épidermique avec l'anti-IgM est possible dans la polyarthrite rhumatoïde, mais cette positivité est moins spécifique que la bande d'IgG constatée dans le lupus. L'IF est habituellement négative dans les sclérodermies et dans la dermatomyosite.
C - Les vascularites
Dans les vascularites liées à des complexes immuns s'observent des dépôts granuleux d'anticorps et de complément dans la paroi des vaisseaux. Les dépôts les plus fréquents sont composés d'IgM et de C3. La présence d'IgA est évocatrice mais non spécifique de purpura rhumatoïde. En dehors de cette affection, l'indication de l'IF est limitée dans le domaine des vascularites car elle ne fournit aucune orientation étiologique. Elle peut être faussement négative si le prélèvement est trop tardif, car les complexes immuns s'éliminent en quelques jours.
 
 
 
 (1) Wick MR, Ritter JH, Humphrey PA, Swanson PE. Immunopathology of nonneoplastic skin disease : a brief review. Am J Clin Pathol 1996 ; 105(4):417-429


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