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Tissu osseux : techniques anatomopathologiques


Tissu osseux : techniques anatomopathologiques
Biopsie chirurgicale :  au bloc opératoire, à ciel ouvert, à l'aide d'une incision.
Microbiopsies : à l'aiguille / trocart, par un Radiologue / Chirurgien, sous contrôle scopique ou scanographique (TDM). Souvent utilisée dans les Centres spécialisés en raison de la moindre morbidité du geste. Elle doit être réalisée après RCP.
Curetage : geste chirurgical qui fragmente la lésion, complet ou partiel (curetage biopsique). Ce n'est pas un geste carcinologique.
Produit d'alésage : obtenu lors de la fixation d'une fracture pathologique avec suspicion de métastase osseuse sous-jacente. TI s'agit d'un matériel osseux très fragmenté et hémorragique provenant du forage de l'os concerné.
Curetage-comblement : technique réservée au traitement des lésions bénignes. Matériel souvent abondant et hémorragique.
La résection osseuse est un geste chirurgical curatif aussi bien pour la pathologie dégénérative, comme l'arthrose de hanche avec résection de la tête fémorale, que pour certaines tumeurs bénignes.
Une laminectomie pour décompression peut aussi être considérée comme une résection osseuse à but curatif, palliative sur le plan carcinologique.
La résection avec limites d'exérèse larges est le traitement de choix des sarcomes mais aussi de certaines métastases osseuses, comme par exemple la métastase unique d'un carcinome rénal à cellules claires.
L'amputation de membre est le traitement chirurgical curatif pour une tumeur osseuse non résécable carcinologiquement par simple résection. L'amputation peut être de nature et de taille variées : un doigt ou un rayon (de pied ou de main), une extrémité (avant-pied, pied, main), un membre entier (jambe, bras) voire un membre et une hémi-ceinture, scapulaire ou pelvienne (désarticulation inter- ilio-abdominale, désarticulation inter-scapulo-thoracique
 
Gestion des prélèvements frais Les prélèvements à visée diagnostique doivent être impérativement communiqués à l'état frais devant toute lésion susceptible de correspondre à une tumeur dont le diagnostic doit être conforté par un diagnostic moléculaire (Ewing).
Pour certains diagnostics potentiellement difficiles, le diagnostic moléculaire peut être utile, comme dans le diagnostic différentiel dysplasie fibreuse / ostéosarcome de bas grade / fibrome desmoplasique de l'os. Nécessité de tissu frais, car la décalcification détruit les acides nucléiques
En plus de la congélation d'un fragment, on peut pratiquer des appositions douces des carottes biopsiques. Une lame peut être rapidement colorée afin d'évaluer la qualité du matériel et d'orienter le diagnostic. Les autres lames sont fixées à l'acétone pendant 10 minutes, emballées dans du papier aluminium, identifiées et gardées à -20°C, ou mieux à -80°C, pour d'éventuelles techniques complémentaires comme une technique FISH, très performante sur matériel cytologique.
Les carottes biopsiques sont incluses en totalité et décalcifiées. Elles peuvent être mises ensemble dans une cassette ou séparées dans plusieurs cassettes si leur consistance est très hétérogène, ce qui permettra une décalcification sur mesure des différents fragments.
Biopsie chirurgicale : Le produit de biopsie est mesuré et décrit : consistance, type (osseux, fibreux, cartilagineux, ... ), présence de parois kystiques, hémorragie, nécrose.
Après prélèvements pour congélation et appositions, le matériel est fixé et sera inclus en totalité après décalcification. Si les fragments biopsiques sont de consistance très hétérogène (certains mous et d'autres de consistance osseuse), il est préférable de les séparer en 2 pots selon leur dureté afin de les décalcifier de la façon la plus adaptée. Le plus facile est de trier les fragments à l'état frais et de les mettre à fixer dans 2 pots différents avant décalcification.
Parfois, le volet cortical ayant permis de pratiquer un orifice dans l'os pour réaliser la biopsie n'est pas remis en place mais transmis au Service d'Anatomie Pathologique. La consistance habituellement très dure de ce fragment de corticale nécessite une décalcification prolongée (jusqu'à 2 semaines !). En fonction des situations, il est possible de ne pas inclure le volet cortical. Cependant, dans le cas où ce fragment est inclus (très intéressant dans les tumeurs cartilagineuses), il faut le techniquer à part et ne pas attendre que la lame correspondante soit prête avant de donner à interpréter les autres lames correspondant aux fragments les moins durs.
Le volume du produit de curetage est évalué en cm3. Pour une meilleure fixation de ce matériel souvent hémorragique, on éponge le sang et trie les fragments des caillots, en renversant le contenu du pot sur du papier absorbant épais et solide et en faisant rouler les fragments sur le papier à l'aide d'une pince. Après séparation des fragments, on les fixe dans des pots séparés correctement identifiés (mous, durs, caillots). Les fragments d'intérêt (mous et durs) seront inclus. Le reste du matériel (caillots, reste de mous et durs) est gardé en réserve.
Pièce de résection et d'amputation pour tumeur osseuse. Après orientation et mesure de la pièce, avant dissection, inspection minutieuse des limites d'exérèse et encrage des limites suspectes. Puis on détache en monobloc les tissus mous du segment osseux en conservant les repères anatomiques et en repérant le trajet de biopsie. S'il est assez facile d'évaluer macroscopiquement la qualité des limites de résection des ostéosarcomes, ce n'est pas le cas pour les tumeurs d' Ewing (bien enrer les limites). Si une pièce volumineuse est communiquée en fin de journée, sans possibilité d'en faire la macroscopie à l'état frais, il est possible de la garder une nuit à +4°C ou de congeler la totalité e la pièce ceci permet de scier la pièce (sans détacher préalablement les tissus mous de l'os) à un moment choisi.
Pour les volumineuses pièces d'amputation de membre (amputation de cuisse, de bras, désarticulation, ... ), on réduit la taille de la pièce pour faciliter la dissection. Ainsi, pour une tumeur du fémur traitée par amputation du membre < ou par désarticulation, on désarticule la jambe du genou pour ne garder que la cuisse. La peau et les tissus mous sont incisés sur toute la longueur du segment, et les muscles disséqués progressivement au contact de la tumeur envahissant les tissus mous, et analyse des rapports de la tumeur avec les vaisseaux, les nerfs et les articulations.
 
Pour les os longs (fémur, tibia, humérus), le plan de coupe frontal est souvent le plus adapté. Deux sections parallèles permettent d'obtenir une tranche entière de la pièce qui sera analysée en totalité pour les tumeurs ayant été traitées par chimiothérapie néo-adjuvante (ostéosarcomes de haut grade et tumeurs d'Ewing). D'autres prélèvements seront également réalisés sur les 2 hémi-pièces restantes.
Les os plats (scapula, os iliaque, sacrum) et les os fins (radius, ulna, péroné) doivent être coupés selon un plan axial, de façon transversale à leur grand axe. De nombreuses coupes étagées de la pièce doivent être réalisées pour pouvoir choisir les tranches les plus représentatives. Pour les os fins, les tranches avec tumeur sont incluses en totalité.
Les tranches de la pièce doivent être photographiées (documentation du cas, cartographie des prélèvements, après chimiothérapie néo-adjuvante).
La pièce peut éventuellement être photographiée avant dissection et ouverture en cas de limite d'exérèse visiblement contaminée.
En raison du risque théorique d'essaimage de la tumeur le long du trajet de biopsie, celui-ci est réséqué avec la tumeur en monobloc (inspection + prélèvement). Le risque d'essaimage est + important dans les chondrosarcomes et ostéosarcomes au stade avancé.
La ou les tranches entières de la pièce sont incluses en totalité avec repérage sur cartographie, les tissus durs sont prélevés avant (nécessité de scie manuelle mais meilleure décalcification de chaque fragment, sans décalcification excessive des fragments les moins durs, qui sont souvent les plus intéressants) ou après décalcification.
Examen extemporané des tumeurs osseuses : dépend des habitudes des équipes chirurgicales et varie énormément d'un Centre à l'autre.
L'examen extemporané peut être justifié :
- sur un prélèvement à visée diagnostique afin de vérifier la qualité du matériel prélevé
- sur un curetage partiel d'une tumeur à cellules géantes pour éliminer une transformation sarcomateuse avant de poursuivre le traitement
- sur les limites d'exérèse (limite osseuse = étude du canal médullaire) au cours de la résection d'une tumeur osseuse maligne.
Le tissu osseux étant difficile à couper au cryostat, il est très intéressant de réaliser, en plus de la coupe, des appositions des différents fragments transmis : elles permettent non seulement l'évaluation de la qualité du matériel, mais aussi une très bonne appréciation des atypies cyto-nucléaires. La coupe à congélation est colorée par un HE rapide et les appositions sont colorées selon les habitudes du Pathologiste.
 
L'étape de fixation avant décalcification est cruciale pour la bonne qualité technique. Une fixation insuffisante avant décalcification est irrécupérable. Le temps moyen estimé optimal de fixation avant décalcification dépend non seulement de son volume mais aussi de la dureté du tissu, de sa richesse en graisse et de son caractère hémorragique
D'expérience, le délai moyen de fixation nécessaire avant décalcification est :
- d'au moins 12 heures pour les microbiopsies
- d'au moins 24 heures pour les biopsies chirurgicales et curetages
- et d'au moins 48 heures pour les pièces de résection, voire plus si la moelle est très adipeuse, comme c'est souvent le cas des têtes fémorales.
 
Décalcification
Décalcifiants acides : acides forts (acide nitrique, acide chlorhydrique) ou faibles (acide formique).
Les premiers sont d'action rapide, mais dégradent les acides nucléiques (pas d’Immunohistochimie : avec l'acide nitrique).
L'EDTA est un chélateur du calcium qui peut être utilisé comme décalcifiant (0.5 M EDTA ou EDTA à 10%, pH 7,4), d’action très lente mais préserve les acides nucléiques et est le seul décalcifiant adéquat pour les études moléculaires sur tissu fixé, décalcifié et inclus en paraffine.
On décalcifie tout prélèvement issu d'un os, même si mou (décalcification courte, de 2 heures car possibilité d’esquilles osseuses (os préexistant ou ostéogenèse réactionnelle) ou tumeur cartilagineuse car la matrice cartilagineuse est souvent minéralisée (enchondromes), les nodules cartilagineux tumoraux sont assez souvent cernés par un liseré d'ossification enchondrale.
Une exception à cette règle est l'absence de matériel congelé pour une lésion suspecte d’Ewing (après tri on inclus sans décalcification les fragments les moins durs).
Pour ne pas décalcifier en excès, tri des fragments pour les mettre en cassettes par similarité de dureté et décalcifier le contenu de chaque "cassette" de façon adaptée. Un excès de décalcification est visible en HE (noyaux délavés, fantomatiques, ne permettant plus de faire la différence entre cellules mal conservées et cellules nécrosées.
Une méthode qui permet d'éviter ces défauts de conservation, de colorabilité et d'antigénicité des noyaux est d'alterner des cycles de décalcification / fixation.
Après fixation adéquate, les prélèvements (en cassette ou non) sont immergés dans le décalcifiant pendant 4 heures, par exemple le matin. L'agitation douce permettrait une meilleure décalcification par homogénéisation de la solution. Il est nécessaire de changer régulièrement la solution de décalcifiant. Puis, les prélèvements sont rincés sous l'eau du robinet (pendant environ 10 minutes si la décalcification a été faite à l'acide formique, 2 à 12 heures si c'est l'acide nitrique qui a été utilisé). L'efficacité de la décalcification est vérifiée par un technicien pour chaque cassette, fragment par fragment, à l'aide d'une pique. Ce test est très subjectif. L'expérience est importante dans ce domaine. Si les prélèvements sont jugés assez décalcifiés, ils sont "refixés" dans du formol à 10% pendant l'après-midi puis lancés dans l'automate à déshydratation sur la nuit. S'ils ne sont pas assez décalcifiés, les prélèvements sont mis à fixer en formol à 10% et remis dans le décalcifiant seulement le lendemain matin.
Autant de cycles que nécessaires sont réalisés. Ainsi, un os cortical épais est décalcifié en 2 semaines maximum en acide (nitrique, chorhydrique ou formique).
 
Avec les colorations à base d'hématoxyline de Harris, le cartilage et le tissu myxoïde sont bleu foncé, ce qui peut gêner l’analyse des caractéristiques cytologiques des chondrocytes. Quand la coloration est trop poussée, les noyaux des chondrocytes ne sont même pas colorés par l'hématoxyline et restent de couleur rose vif. Cet inconvénient est absent avec les colorations par l'HES à base d'hémalun de Mayer. Celui-ci ne colore pratiquement pas les matrices cartilagineuses et myxoïdes (gris pâle ou beige clair avec des noyaux de chondrocytes bien colorés). L'utilisation du safran permet de mieux visualiser la substance ostéoïde, qu'elle soit minéralisée ou non.
 
L'immunohistochimie sur tissu fixé et décalcifié ne pose pas de problème avec les Ac du commerce et avec les techniques de démasquage par la chaleur et/ou d'amplification du signal, à condition que le tissu ait été correctement fixé avant décalcification et décalcifié à l'EDTA ou à l'acide formique, et pas de façon prolongée. Néanmoins, l'immunoréactivité des antigènes nucléaires est souvent nettement diminuée par rapport à celle d'un tissu non décalcifié, comme c'est le cas pour le TTF1 le Ki-67, les RE / RP, le MDM2 et le CDK4.


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