» Biologie et génétique Diagnostic bactériologique d'infection

Diagnostic bactériologique d’infection


Le diagnostic bactériologique d'une infection : Les bactéries sont classées en grandes familles, en genres et espèces. Un genre peut comporter plusieurs espèces génétiquement proches. Les bactéries sont désignées uniquement par noms de genre et d’espèce. En l’absence d’identification précise d’une espèce, on utilise la nomenclature sp. Chaque espèce est constituée de souches ou isolats bactériens, qui présentent des variations phénotypiques (sensibilité aux antibiotiques, tests biochimiques…) et sont définies par un profil génétique de restriction qui leur est propre. Certaines espèces bactériennes sont oligoclonales, c’est-à-dire qu’elles ne comprennent que très peu de souches, d’autres sont très hétérogènes comprenant beaucoup de souches (hétéroclonales). L’isolement d’une même souche chez plusieurs patients définit une épidémie.
On cherche d’abord à détecter la bactérie ou ses constituants (protéines, polyosides, acides nucléiques). Il faut ensuite isoler en culture et identifier le genre et l’espèce de la bactérie.
La souche isolée pourra être caractérisée par des marqueurs épidémiologiques pour éventuellement la comparer à des souches de même espèce isolées chez d’autres patients, dans le but de reconnaître une épidémie.
Le diagnostic direct peut être complété en détectant des anticorps, ce n’est pas une preuve absolue.
Les prélèvements sont guidés par la symptomatologie et l’examen clinique et doivent être effectués :
- Le plus tôt possible, avant antibiothérapie
- A la porte d'entrée cutanéo-muqueuse, dans le sang lors de la dissémination (bactériémie) et éventuellement dans les organes cibles (LCR, abcès profonds par ponction, épanchements...).
- De façon stérile et rapidement acheminés au laboratoire
Il existe des prélèvements mono-microbiens, provenant de sites normalement stériles (sang, urine, LCR, tissus...) , et pour cela d’interprétation assez facile.
A l’opposé, il existe des prélèvements polymicrobiens provenant du revêtement cutanéo-muqueux avec flore commensale (gorge, selles, vagin, peau). Il faut repérer une bactérie pathogène au milieu de bactéries commensales souvent très abondantes.
L'examen microscopique : acte fondamental du diagnostic bactériologique .
- examen en lumière blanche à l’état frais et après coloration : de Gram, de Ziehl-Neelsen (mycobactéries), à l’argent (bactéries fines : tréponèmes, spirochètes…) ;
- Examen en fluorescence (mycobactéries…)
- Examen en contraste de phase et au fond noir (pour les bactéries très fines)
Celui-ci précise : l’abondance / diversité de la flore bactérienne (monomorphe, polymorphe), la forme des bactéries (coques, bacilles, spiralés…), leur taille (1-10 µ), l’association des bactéries entre elles (diplocoques, amas, chaînettes…), leur caractère Gram + ou Gram - (ou mycobactéries, spirochètes…) et leur position intra ou extracellulaire, l’intensité de la réaction inflammatoire (polynucléaires neutrophiles, hématies, monocytes, lymphocytes).
Détection des antigènes solubles dans les produits pathologiques : par Ac monoclonaux (mAb ), lors de tests dit au latex, ELISA, ou par immunofluorescence. Ces tests restent peu sensibles et requièrent un nombre élevé de bactéries ( > 105-6 / mL).
Isolement et identification en culture : Les conditions de culture sont les milieux de culture, la présence ou non d’oxygène et la température d’incubation des bactéries.
La majorité des bactéries croissent in vitro sur milieux de culture (milieux gélosés et bouillons) : milieux ordinaires (type gélose trypticase-soja), milieux enrichis (sérum, sang, ascite), milieux sélectifs (contenant des antiseptiques), milieux liquides d'enrichissement (contenant des antiseptiques ou incubés à une température non permissive pour la flore commensale mais laissant croître certaines bactéries pathogènes).
Les bactéries sont incubées en aérobie ou anaérobie, ou en présence de C02 ( 5-10%), définissant des bactéries aérobies, anaérobies ou microaérophiles (10% O2 ).
La température d’incubation est habituellement de 35-37°C.
La vitesse de croissance peut être rapide en 24-48h, (20 min à 60 min de temps de génération pour la plupart des bactéries médicales courantes, telles que staphylocoques, streptocoques, entérobactéries…). Certaines bactéries sont de croissance lente : Mycobacterium tuberculosis croît en 2-3 semaines (temps de génération 24-48 h). Certaines bactéries ne peuvent être cultivées in vitro (Mycobacterium leprae, Treponema pallidum) et ont un temps de génération très long in vivo chez l’animal de 12-14 jours. Certaines bactéries nécessitent des milieux de culture particuliers leur fournissant les nutriments et les conditions (osmolarité…) nécessaires à leur croissance ( Mycoplasma, Borrelia, Leptospira). Certaines bactéries sont des parasites intracellulaires stricts, comme les virus, et requièrent des milieux de culture cellulaire (Chlamydia, Rickettsia, Tropheryma whippelii).
Pour la plupart des bactéries médicales courantes (staphylocoques, streptocoques, entérobactéries), des colonies visible à l’œil nu apparaissent sur la gélose habituellement en 24-48 h. Chaque colonie correspond à 1-2 x 109 bactéries et résulte de la multiplication rapide d’une seule bactérie (clonage). On note l’aspect des colonies, leur taille (1-3 mm), leur éventuelle pigmentation (vert, jaune, rouge), la présence d’une hémolyse sur gélose au sang.
La suite du processus d’identification part de colonies isolées pour définir les caractères biochimiques d’identification.
Identification de l’ espèce bactérienne : on identifie la bactérie suspecte sur des caractères morphologiques, nutritionnelles, respiratoires et biochimiques.
Les caractères morphologiques des bactéries et de leurs colonies : coque, bacille, bactérie spiralée, Gram + ou -, ou non colorable par la coloration de Gram ( Ziehl-Neelsen).
Les exigences nutritionnelles bactérie nécessitant des milieux enrichis (hémine, ascite, sérum, sang ...) et requérant ou non des facteurs de croissance : bactéries auxotrophes (facteurs de croissance : aminoacides, vitamines…) ou prototrophes (croissance sans facteur de croissance).
- Les propriétés de respiration et de fermentation : bactérie aérobie, anaérobie ou aéro-anaérobie, capable de respiration et/ou de fermentation des sucres, utilisation des sucres (fermentation avec ou sans gaz) détectée par les galerie dites API.
- La production d’enzymes (catalase, oxydase, nitrate-réductase, protéases, lécithinases,...).
L’ensemble de ces caractères biochimiques définit le phénotype de la bactérie ou biotype.
Dans un but épidémiologique, on précise l’identité de la souche : d’après les antigènes du LPS pour les Gram -, les polyosides capsulaires, protéines d'enveloppe externe (sérotypage par agglutination avec des sérums spécifiques).
- La sensibilité à une batterie de phages définit des lysotypes (lysotypie).
- Les techniques de biologie moléculaire définissent la singularité d’une souche bactérienne.
Les techniques les plus utilisées sont électrophorèse en champ pulsé (PFGE), ribotypage et random PCR. La PCR augmente considérablement la sensibilité de détection des microorganismes voire de microorganismes éventuellement non viables. Utile si bactéries à croissance lente, difficile ou impossible :
- Bordetella pertussis (coqueluche), bacille Gram - à croissance difficile
- bactéries intracellulaires strictes : Chlamydia trachomatis et C pneumoniae, Rickettsia spp (typhus), Tropheryma whippeli (Whipple)
- les mycobactéries de la tuberculose (Mycobacterium tuberculosis, M bovis) et de la lèpre (Mycobacterium leprae)
- les mycoplasmes : Mycoplasma pneumoniae, Ureaplasma urealyticum.
- Treponema pallidum (syphilis).
La PCR pourrait aussi être utile pour les infections où le diagnostic doit être rapidement établi (méningites), ou pour détecter une résistance aux antibiotiques d’une bactérie à croissance lente, telle que M. tuberculosis.
La PCR pour identifier une bactérie inconnue dans les tissus infectés et en culture.
L’amplification de séquences de rDNA utilisant des primers universels ou de certains gènes bactériens avec des primers spécifiques, peut être utile dans certains contextes cliniques difficiles, tels que les infections torpides des immunodéprimés.
L’antibiogramme définit in vitro la sensibilité des bactéries pathogènes (méthode des disques, qui permet de voir le diamètre d’inhibition de croissance autour des disques imprégnés d’antibiotiques). Sinon détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) et des concentrations minimales bactéricides.
Le diagnostic indirect : détection des Ac spécifiques : Le sérodiagnostic est un appoint au diagnostic direct. Il est utile si : recherche de bactérie à croissance difficile ou impossible (Treponema pallidum, Chlamydia, Rickettsia, Leptospira, Borrelia), diagnostic d’infections décapitées par les antibiotiques (antibiothérapie précoce), diagnostic rétrospectif d’une infection récente
Les Ac apparaissent en 7-10 j (agglutination, ELISA), avec apparition d’IgM spécifiques, avec pic de production entre 21 et 30 j, les titres diminuant ensuite pour atteindre un taux résiduel (IgG) après 2-3 mois qui persistera des années.
On pratiquer 2 tests sérologiques : un sérum le plus précoce possible après le début clinique (souvent négatif), un sérum tardif 15 jours plus tard. Si ce 2ème test est positif, on parle de séroconversion (apparition d’Ac spécifiques). Une ascension des titres d’Ac est aussi un bon signe en faveur d’une infection en évolution (souvent une primo-infection), mais réactions antigéniques croisées fréquentes avec d’autres bactéries. Le sérodiagnostic est donc un diagnostic de suspicion. Son interprétation attachera une bonne valeur à la détection d’IgM, d’une séroconversion, ou d’une ascension des titres d’anticorps.


Documents de pathologie humaine du service d’anatomie pathologique du CFB de Caen et du CHPC de Cherbourg. L ’UTILISATION DES INFORMATIONS FOURNIES SE FAIT SOUS L’UNIQUE RESPONSABILITE DE L’UTILISATEUR. Les concepteurs et réalisateurs de cette base ne sauraient en aucun cas être tenus pour responsables des conséquences d’une utilisation non contrôlée des informations fournies.

Performed by Arnaud Legrand 2009 © All Rights Reserved.