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Principes de biologie moléculaire


La biologie moléculaire étudie les macromolécules extra et intracellulaires (acides nucléiques, ADN et ARN, et protéines, et vastes complexes moléculaires associant lipides complexes, polysaccharides, protéines et acides nucléiques.

L’acide désoxyribonucléique ou ADN a une structure en double hélice, formée de 2 brins antiparallèles et strictement complémentaires en ce qui concerne la séquence des 2 bases (complémentarité adénine-thymine et guanine-cytosine) portées par les montants phosphodésoxyribosiques. Elle est le support de l’information génétique de toute vie (séquence des bases puriques (adénine et guanine) et pyrimidiques (cytosine et thymine) le long de la molécule, avec un code nucléotides-acides aminés universel).

L’ADN est surtout nucléaire chez les eucaryotes, organisé au sein des chromosomes, mais une faible partie est contenue dans les mitochondries.
L’ADN nucléaire est intimement associé à diverses protéines qui interviennent dans la structure des chromosomes (histones essentiellement, formant des unités appelées nucléosomes) ou dans la régulation de l’activité génique.
Sur le plan fonctionnel, l’ADN est réparti en régions codantes ou exons (2 % de l’ADN total) pour des protéines ou des ARN, régions contenues dans les gènes, et en régions non codantes ou introns, majoritaires quantitativement, qui comprennent notamment les régions régulatrices dont celles situées en amont du 1er exon, notamment la région dite promotrice.
Un gène peut être défini comme une unité fonctionnelle d’ADN (ensemble de séquences) contenant l’information nécessaire à la production d’un ARN particulier ou d’une protéine particulière. Seul un brin de la molécule d’ADN est transcrit.
Une grande partie de l’ADN n’a pas de fonction encore bien définie avec notamment des séquences hautement répétées comme les microsatellites, servant de balises au même titre que les sites de restriction.
L’ADN peut être coupé in vitro par des enzymes particulières d’origine bactérienne, les enzymes de restriction, qui agissent sur des séquences d’ADN spécifiques appelées sites de restriction.
La topographie et même la présence de ces sites de restriction sur l’ADN, situés dans ou en dehors des gènes, peut varier entre 2 individus d’une même espèce, introduisant un certain polymorphisme dont on peut tirer partie en recherche et pour certaines applications diagnostiques.
D’autres sites sont fixes, permettant d’établir une véritable cartographie de l’ADN.
Les distances sur la molécule d’ADN sont actuellement mesurées en kilobases (103 bases = 1 kb) ou en mégabases (106 bases = 1 mb).
Par exemple, l’ADN d’une cellule humaine mesure environ 3 000 mb et on estime qu’il contient environ 100 000 gènes.

Les acides ribonucléoprotéiques ou ARN ont une structure primaire proche de celle de l’ADN, la thymine est remplacée par l’uracile et ils ne sont le plus souvent constitués que d’un seul brin.

Ils sont impliqués dans la synthèse des protéines et sont de 3 types : ARN ribosomaux (ARNr) intervenant dans la traduction des ARN messagers (ARNm), ARN de transfert (ARNt) permettant le transfert des acides aminés intracellulaires sur la chaîne polypeptidique en cours d’élongation, et ARNm destinés à être traduits en protéines dans les complexes ribosomaux, en suivant le code génétique.
Tous ces ARN sont synthétisés en regard du brin codant d’un gène, dans le noyau, par une machinerie très complexe utilisant des ARN polymérases diverses (type I à III selon le type d’ARN).
Ils sont toujours associés à des protéines très diverses, sous forme de particules ribonucléoprotéiques ; ils sont toujours monocaténaires sauf chez certains virus et sont souvent repliés sur eux-mêmes par hybridation intramoléculaire (structures secondaires).
Dans le cas des ARNm, les plus nombreux, l’ensemble du brin actif d’ADN, exons et introns, est d’abord copié ou transcrit, = transcript primaire d’ARN.
Les régions de ce transcript primaire correspondant aux introns sont ensuite excisées (épissage) aboutissant à un ARNm mature, prêt à être traduit, après diverses autres modifications de structure.
À la différence de l’ADN, molécule remarquablement stable dont la quantité par cellule est fixe en dehors de la mitose, le contenu et la composition en ARN, notamment messagers, sont très variables selon l’activité des gènes cellulaires, d’autant plus qu’il s’agit souvent de molécules instables à demi-vie courte.
Leur étude quantitative permet donc celle de l’activité récente des gènes du tissu étudié, nécessairement très variable selon le type de tissu.
Enfin, les ARNm matures sont traduits, c’est-à-dire qu’ils permettent la synthèse d’une protéine particulière dans les complexes ribosomaux associés au réticulum endoplasmique rugueux ou granuleux.
Fonctionnement du génome eucaryote : très complexe et incomplètement compris, notamment en ce qui concerne sa régulation.
Transcription génique : à partir des brins codants d’ADN grâce à l’action d’un complexe moléculaire constitué autour de l’ARN polymérase III (complexe de transcription).
Ce complexe se fixe sur une région +/- étendue, située sur le brin codant, en amont du 1er exon du gène à transcrire, région appelée promoteur.
Celui-ci comporte des séquences universelles ou boîtes (TATA box ; CAAT box) situées très près du début de l’exon, mais aussi des séquences plus spécifiques parfois plus éloignées, variables en fonction du gène en cause, appelées séquences régulatrices.
Ces séquences ou éléments en « cis », car situés sur le même brin d’ADN que le brin codant, sont en fait des sites de fixation de protéines spécifiques, régulatrices, appelées éléments en « trans ».
On peut subdiviser ces éléments régulateurs en séquences enhancer et silencer selon l’impact sur l’activité transcriptionnelle de la liaison protéine-séquence régulatrice, liaison qui interfère avec la fixation et l’activité du complexe de transcription.
Un certain nombre de protéines régulatrices sont assez ubiquitaires, participant à la régulation d’un grand nombre de gènes.
On les appelle facteurs de transcription ; ils servent par exemple de deuxième ou troisième messager, nucléaire, relayant un message reçu par la cellule, message qui doit finalement aboutir à une régulation de l’activité génique.
De nombreux proto-oncogènes et certains gènes suppresseurs de tumeurs codent pour de tels facteurs de transcription, notamment les produits des gènes c-myc, c-fos, c-jun, p53, NF/ºB, etc.
Régulation post-transcriptionnelle : concerne les éléments affectant la stabilité des ARNm, la traduction elle-même, et les modifications protéiques post-traductionnelles qui modulent l’activité et la stabilité des protéines (phosphorylations, sulfurations, glycosylations, etc).
Elle est parfois essentielle dans la régulation de la quantité et/ou de l’activité de la protéine finale.
Pathologie de l’ADN et conséquences :
Les mutations sont des modifications de diverses origines de la séquence normale de l’ADN, sur les régions codantes, régulatrices ou sans fonction définie.
Elles sont de différents types : translocations avec ou sans fusion génique, insertions, délétions, substitutions, et portent soit sur des régions de grande taille ou de taille plus réduite (quelques bases), soit sur une seule base (ponctuelles).
Les translocations concernent en principe des fragments de grande taille.
Pour les délétions, on parle de perte d’hétérozygotie quand une portion de chromosome contenant un ou plusieurs gènes disparaît, laissant le (ou les) autre(s) gène(s) homologue(s), situé(s) sur l’autre chromosome de la paire (s’il s’agit d’un autosome), seul(s), en situation d’hémizygotie, cette situation est notamment fréquente pour les mutations germinales de gènes suppresseurs de tumeurs, l’anomalie ne s’exprimant le plus souvent que si la version normale du gène disparaît, disparition qui se produit dans les cellules tumorales et elles seules (théorie des deux « coups » de Knudson).
Dans le cas des mutations ponctuelles, on parle de transition en cas de passage d’une base purique ou pyrimidique à une base du même type, et de transversion dans le cas contraire.
Les conséquences sont variables selon la topographie et le type de mutation en cause : modifications de la stabilité de l’ARNm correspondant, ou dérégulation de la transcription génique (activité constitutive ou inhibition permanente) aboutissant à une modification du taux de synthèse de la protéine ; modifications de l’épissage introduisant une nouvelle région dans la protéine ou au contraire amputant sa séquence ; modification avec « glissement » du cadre de lecture, avec apparition d’une protéine totalement modifiée, parfois tronquée (en cas d’apparition d’un codon « stop » c’est-à-dire ne correspondant à aucun acide aminé et arrêtant la synthèse de la protéine), d’activité très différente de la normale, ou même absence de synthèse protéique (si le codon « stop » apparaît très tôt) ; mutations ponctuelles non sens ou « faux sens » (substitution d’acide aminé) entraînant, là aussi, la synthèse d’une protéine tronquée ou modifiée ponctuellement.
Toutes ces anomalies peuvent perturber profondément le fonctionnement cellulaire quand il s’agit d’une protéine clé, notamment impliquée dans un métabolisme fondamental ou dans l’équilibre mitose/différenciation.
Ces mutations ne doivent pas être confondues avec la présence d’un polymorphisme qui ne retentit pas sur la séquence de la protéine ou qui modifie légèrement la séquence sans changer l’activité.
Parfois, le type de mutation évoque l’agent mutagène : mutations induites par les ultraviolets (UV) du gène p53 et dimères de thymines.
Amplification génique : présence en plusieurs exemplaires d’un même gène (parfois plusieurs centaines d’exemplaires), souvent arrangés en tandem, dans un locus donné, si amplification marquée, elle est parfois visible en cytogénétique sous forme de minichromosomes surnuméraires (chromosomes double-minutes). Elle peut aboutir à une surexpression du gène (proto-oncogènes cellulaires lors de certains cancers).
Principales techniques de biologie moléculaire :
Manipulation de fragments d’acides nucléiques (coupe spécifique par enzymes, ligations diverses) visualisés par hybridation moléculaire (appariement de 2 fragments d’acide nucléique par complémentarité de leurs bases qui se lient 2 à 2 par liaisons non covalentes (duplex ADN/ADN, ARN/ADN ou ARN/ARN) = principe de la sonde moléculaire).

On utilise soit l’ADN génomique, extrait du noyau des cellules, soit l’ADN complémentaire (ADNc) obtenu par rétrotranscription in vitro à partir des ARNm.

L’ADNc est plus facile à manipuler que l’ARNm dont il est issu. Il est le reflet de l’activité transcriptionnelle de la cellule mais ne comporte que les séquences codantes des gènes.
Southern-blot et étude des polymorphismes de restriction : introduite dès 1975 par Southern, détecte, par une sonde marquée et spécifique, un fragment d’ADN issu d’une digestion par enzymes de restriction. L’ADN total extrait est digéré par une ou plusieurs enzymes de restriction. Les fragments de restriction obtenus sont séparés selon leur taille par électrophorèse, puis transférés par capillarité (blotting) sur une membrane (nitrocellulose ou Nylon). La membrane est incubée avec une sonde marquée qui s’hybride spécifiquement avec le fragment comportant la séquence complémentaire.
Le résultat s’inscrit comme une « bande » visible par divers moyens selon le type de marquage de la sonde (autoradiographie si elle est radioactive).
Elle donne des indications sur sa taille et, moins précisément, sur la quantité de fragment reconnu (par exemple pour une recherche de perte d’hétérozygotie ou d’amplification).
Une ou deux bandes sont mises en évidence, selon l’enzyme, la sonde et l’état homo- ou hétérozygote vis-à-vis de la région étudiée.
Cette technique permet la détection de modifications de grande taille du fragment étudié, notamment des grandes délétions ou insertions, des translocations avec fusion de gènes, d’une perte d’hétérozygotie et des amplifications.
On peut également l’utiliser pour vérifier la spécificité d’un produit d’amplification par la PCR, sans avoir à recourir au séquençage.
Cette technique est grossière, le fragment reconnu ne représentant souvent pas plus d’un millionième des fragments en présence.
Le southern-blot est utilisé pour l’étude des polymorphismes de restriction ou RFLP (restriction fragments length polymorphism). Elle détecte des variations de taille des fragments de restriction pour une enzyme donnée.
Cette variabilité est liée au fait que les positions des sites de restrictions peuvent être physiologiquement différentes (ces sites pouvant même être totalement absents de certains allèles) pour chaque allèle d’un gène (polymorphisme).
On peut alors suivre la transmission, dans une famille, d’un profil particulier de restriction, correspondant à un allèle particulier représentant par exemple une version mutée du gène, ou correspondant simplement à un site polymorphe non spécifique mais proche d’un gène dont on veut pister un allèle muté
Amplification par réaction de polymérisation en chaîne ou PCR
Le principe de la PCR consiste à utiliser, de manière répétitive, l'une des propriétés des ADN polymérases : celle de ne pouvoir synthétiser un brin complémentaire d'ADN qu'à partir d'une amorce. Eléments nécessaires : l’ADN sous forme de double-brin, contient le fragment à amplifier. Deux amorces, sens et anti-sens quisont de petits brins d'ADN d'environ 20 bases, (oligonucléotides) capables de s'hybrider de façon spécifique, grâce à la complémentarité des bases, sur le brin d'ADN ou sur son brin complémentaire. Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d'ADN à amplifier. La Taq Polymerase (Taq Pol), une ADN polymérase thermorésistante extraite de la bactérie Thermus aquaticus. Sa température optimale d'action est de 72°C et elle est capable de résister à des passages successifs à 95°C, ce qui a rendu possible l'automatisation de la procédure. 4 nucléotides :dGTP, dATP, dTTP, dCTP, ou dNTPs (DésoxyNucléotides-Tri-Phosphates), qui sont les éléments de base utilisés par la Taq Pol pour synthétiser les brins d'ADN complémentaires. Une réaction de PCR correspond à la succession d'une trentaine de cycles comportant chacun 3 étapes : Dénaturation, Hybridation, Elongation. Tous les éléments nécessaires à la réaction sont regroupés dans un tube qui sera soumis aux différentes températures correspondant à chaque étape. Ces cycles de température sont réalisés automatiquement dans un thermocycleur.
Dénaturation : Le tube est chauffé quelques secondes à 94°C. Les double-brins d'ADN se séparent. On dit alors que l'ADN est dénaturé. Hybridation : La température est rapidement abaissée à 55°C. Les amorces « reconnaissent » leur séquence complémentaire sur les brins d'ADN cibles. Elles s'hybrident chacune sur leur brin respectif. Cette étape dure une minute afin de laisser le temps aux amorces de s'hybrider correctement. L'ADN total plus long, n'aura pas le temps de se réhybrider. Élongation : La température du tube est ensuite augmentée à 72°C, ce qui permet à la Taq Pol d'ajouter des nucléotides aux amorces hybridées, dans le sens 5' vers 3'. Les nucléotides ne sont pas incorporés de façon aléatoire mais en fonction de la séquence cible (nucléotide complémentaire). Cette étape dure 1 minute.
Un nouveau brin d'ADN, dont la séquence est complémentaire de celle du brin cible, vient d'être synthétisé. Le premier cycle permet de synthétiser autant de brins complémentaires (plus courts puisque bornés par une amorce) que de brins cibles présents dans le tube. Ils deviennent à leur tour des ADN cibles. Au 2ème cycle les premiers brins, dont la taille est limitée par les deux amorces font leur apparition. Au 3ème cycle, les premiers amplicons apparaissent, ADN double-brins bornés par les amorces, correspondants au fragment d'ADN recherché. La taille des fragments varie généralement de 50 paires de bases (pb) à 2 kilobases (Kb). Au fil des cycles la quantité d'amplicons va augmenter de façon exponentielle. On obtient, en théorie 2n copies pour n cycles. Dans la pratique, pour un rendement classique de 85%, une PCR de 30 cycles produit environ 106 copies (amplicons de taille attendue), qu’on visualise avec le Bromure d'Ethidium (BEt), produit intercalant qui se glisse entre les bases des acides nucléiques. Lorsqu'elle est intercalée, cette molécule présente une fluorescence orange sous illumination par des UV courts (environ 300 nm). Les produits d'amplification sont soumis à une électrophorèse en gel d'agarose. Cette électrophorèse permet de faire migrer les acides nucléiques au travers du gel additionné de BEt. La vitesse de migration étant dépendante de la masse moléculaire, donc du nombre de bases de l'ADN testé, la présence et la taille des amplicons pourront être vérifiées.
La PCR s’est imposée par sa simplicité pour devenir une des techniques de routine de la biologie moléculaire. Cette technique nécessite la connaissance préalable au moins de la séquence des extrémités de la région à amplifier. Le taux d’erreur est minime mais limite la longueur totale amplifiable de façon fiable. Elle peut être utilisée par exemple comme préalable avant séquençage, SSCP (single strand conformation poylmorphism), électrophorèse sur gel avec gradient de dénaturation ou tout autre technique de manipulation du fragment obtenu.
On peut également s’en servir pour détecter un ARNm (et avoir une idée de sa quantité) par l’amplification de l’ADNc correspondant, d’une séquence anormale par exemple virale ou correspondant à une version mutée d’un gène cellulaire normal, d’une délétion importante (diminution de la taille du fragment ou absence d’amplification) ou même d’une substitution ponctuelle. Dans ce dernier cas, le fragment amplifié est transféré sur membrane et hybridé avec une sonde très spécifique de petite taille.
L’hybridation ne pourra alors pas être détectée si une base a été modifiée, alors qu’elle pourra l’être si le fragment est complètement normal.
Inversement, une mutation ponctuelle particulière peut être mise en évidence en utilisant une sonde reconnaissant spécifiquement celle-ci, à condition de la connaître à l’avance.
Il s’agit donc d’une technique beaucoup plus sensible que le southern-blot pour détecter la présence d’une séquence particulière. Dans les cas où la biologie moléculaire n’est pas possible, car trop peu de matériel, on peut proposer une technique de transfert cellulaire à partir de lames histologiques avec juqu’à 85% de succès avec des résultats similaires aux techniques classiques Arch Pathol Lab Med. 2016 Dec ;140(12):1383-1389. Séquençage direct : analyse directe de l’enchaînement des bases, souvent, elle est réalisée après amplification génique ou clonage du fragment d’intérêt, par diverses méthodes souvent semi-automatisables.
Polymorphisme de conformation de l’ADN monocaténaire ou SSCP : migration des 2 brins simples d’un fragment d’ADN, en général préalablement amplifié dans un gel d’acrylamide non dénaturant. Les brins monocaténaires ont une configuration spatiale qui dépend de leur séquence, or une mutation ponctuelle peut la modifier et entraîner une modification du profil de migration. Les brins sont rendus visibles par marquage radioactif ou sont visualisés par une coloration du gel à l’argent. Cette méthode assez simple de dépistage des mutations ponctuelles, peut être complétée par un séquençage précis.
L’électrophorèse sur gel d’acrylamide avec gradient dénaturant et la technique d’analyse des hétéroduplex sont basées sur un principe similaire.
Hybridation in situ (HIS) : visualisation directe sur coupe tissulaire ou chromosome, d’une séquence d’ADN, par hybridation spécifique avec une sonde marquée qui rend visible le duplex sonde/ADN. Détermination de la présence de l’ADN d’agents infectieux notamment intracellulaires, même en petit nombre, tels les virus où théoriquement moins de 10 copies par cellule suffisent à faire apparaître un signal. Analyse chromosomique, avec sondes fluorescentes (FISH) qui localisent une séquence connue sur tel ou tel chromosome.
Hybridation sur tache ou dot-blot : technique d’hybridation sur support, avec filtre de Nylon sur lequel est déposé l’ADN préalablement dénaturé à étudier sous forme d’une tache, on y rajoute la sonde marquée, la révélation des hybrides est réalisée après plusieurs lavages.
Cette technique ne nécessite pas de digestion préalable de l’ADN mais expose au risque de faux positifs.
Après amplification préalable et conditions de forte stringence (n’autorisant le maintien sur le support que des hybrides strictement complémentaires après lavage), le dotblot permet la détection de mutations ponctuelles.
Une banque d’ADN intègre de multiples fragments d’ADN dans des vecteurs, présents à de multiples exemplaires dans la banque, à raison d’un fragment par vecteur. Ce vecteur peut être un virus bactériophage ou un fragment d’ADN appelé plasmide ou cosmide.
Ces banques peuvent concerner soit les séquences codantes (les exons), il s’agit alors de banques d’ADNc, soit l’ensemble de la séquence génomique où tous les éléments de l’ADN (régions promotrices, exons, introns, etc) sont alors représentés.
La composition des banques d’ADNc varie selon les ARNm présents et donc suivant le type de cellule utilisé pour la constitution de la banque.
En revanche, la composition d’une banque génomique ne dépend que de l’espèce et non du type cellulaire.
Pour identifier une protéine, on peut utiliser une banque d’ADNc dans un vecteur permettant l’expression des protéines codées par ces ADNc (vecteur d’expression ayant un promoteur pour l’ARN polymérase).
La protéine produite par le vecteur peut ensuite être recherchée par un anticorps spécifique marqué. L’ADNc est alors extrait du vecteur puis séquencé et on peut en déduire la séquence exacte de la protéine (la protéine a été clonée).
Grâce à cette technique, les gènes codant pour les Ag des maladies auto-immunes ont pu être identifiés et étudiés, permettant de mieux préciser les Ag en cause (application aux dermatoses bulleuses auto-immunes).
Clonage et transfection : Des fragments d’ADN peuvent être manipulés, introduits dans des vecteurs rétroviraux, plasmidiques ou cosmidiques, voire des structures encore plus importantes, puis ces vecteurs peuvent être introduits par divers moyens dans des cellules bactériennes ou eucaryotes (transfection) modifiant la fonction de ces cellules si le vecteur permet l’expression du gène.
C’est la base de la thérapie génique, du génie génétique et du « clonage » moléculaire qui permet la production en grand nombre du fragment introduit grâce à la réplication des acides nucléiques dans la cellule transfectée, réplication qui s’applique aussi au fragment introduit.
Techniques de « traque » d’un gène et génétique « inverse » : Manipulation de grands segments d’ADN par exemple par électrophorèse en champ pulsé qui sépare les fragments d’ADN de très grande taille, l’inclusion des fragments d’ADN dans des chromosomes artificiels transfectables dans la levure, cellule eucaryote de manipulation assez aisée, etc.
Des manipulations géniques permettent par exemple d’obtenir des fusions géniques et donc des protéines de fusion avec propriétés biologiques à la demande.
Le gène est d’abord localisé aussi précisément que possible sur le génome par encadrements successifs de + en + fins, par méthodes de coségrégation de la maladie avec divers marqueurs génomiques souvent anonymes (sites de polymorphisme pour une enzyme de restriction, microsatellites), ceci au sein d’une famille où plusieurs membres sont atteints.
Après localisation : soit la région où est localisé le gène est déjà connue et on sait qu’elle comprend un certain nombre de gènes qui codent pour des protéines dont la fonction est connue ou pas, soit la région est peu ou non connue.
Dans le premier cas, on peut sélectionner un ou plusieurs gène(s) dit « candidat(s) », par exemple en raison de la structure, de la fonction ou encore de la localisation de la protéine codée, dont une perturbation pourrait logiquement être responsable de la symptomatologie clinique (par exemple une protéine de la région de la membrane basale dans le cas des épidermolyses bulleuses).
On essaie alors de confirmer cette « candidature » en recherchant des mutations de ce ou ces gène(s) chez les patients et/ou leur famille.
En l’absence de gène candidat, situation assez fréquente, on recourt à des techniques souvent longues et fastidieuses, de nature complexe, pour isoler la région d’intérêt dans un vecteur permettant son étude précise, d’y déterminer la présence de gènes et de les sélectionner si possible, même sans connaître la protéine codée.
On peut par exemple examiner pour lequel de ces gènes l’ARNm n’est pas en quantité voulue ou n’a pas la taille habituelle chez les malades.
On peut également cribler une banque d’ADNc du tissu lésé, par exemple la peau, en utilisant des fragments de la région chromosomique en question comme sonde.
Le (ou les) gène(s) devenu(s) candidat(s) sera(ont) alors séquencé(s) chez les patients, en comparant cette séquence avec la séquence normale.
 
L’étude des ARNm apporte des informations sur l’expression, fonctionnement global en termes de transcription mais aussi de régulation post-transcriptionnelle du génome.
Northern-blot : Appelée ainsi par référence au southern-blot : extraction des ARN cellulaires, purification des ARNm, migration électrophorétique dans un gel qui les sépare suivant leur taille, transfert sur un support (Nylon par exemple) puis révélation de la présence de l’ARNm étudié par hybridation avec une sonde spécifique (ARN ou ADN).
La quantité relative de messager peut être estimée par rapport à l’expression d’un gène dont le taux d’expression est constant (gène dit de « ménage » ou housekeeping) et la taille du transcrit est appréciée par rapport à celle d’ARN ribosomaux ou à une échelle de poids moléculaire.
Hybridation in situ : comme pour l’ADN : visualisation directe de la présence, sur coupe tissulaire, d’un ARNm particulier, par hybridation avec une sonde marquée ADN ou ARN qui rend visible le duplex sonde/ARN.
La quantité d’ARN présente peut aussi être estimée de façon semi-quantitative en utilisant un analyseur d’image couplé à un logiciel de comptage.
RT-PCR (reverse transcriptase-PCR) : détermine avec grande sensibilité la présence d’un ARNm très peu abondant. Même principe que celui de la PCR mais avec étape préalable de synthèse d’ADNc à partir des ARNm extraits, grâce à la transcriptase reverse.
L’ADNc complémentaire correspondant à l’ARNm étudié est alors amplifié selon les mêmes modalités qu’un ADN génomique.
Cette technique est facilitée par l’emploi d’enzymes qui ont à la fois une activité transcriptase reverse et une activité ADN polymérase.
Comme pour la PCR, il faut toutefois se méfier des faux positifs dus à la grande sensibilité de la méthode (contaminants) et s’entourer de contrôles.
Animaux transgéniques : étude des conséquences de l’introduction directe d’un gène modifié, le transgène, dans le zygote (ou oeuf fécondé) d’un animal (souris ou batracien).
Les œufs portant le transgène sont alors réintroduits dans une femelle gestante. Les animaux transgéniques (porteurs du transgène) sont ensuite repérés par analyse de l’ADN extrait de leur queue (présence ou absence du transgène). Par des croisements de ces animaux, l’obtention d’animaux homozygotes pour le transgène étudié est possible.
Le pendant des animaux transgéniques est représenté par les animaux (surtout souris) Knock-out chez lesquels un gène bien précis a été inactivé au stade de zygote ; on peut ainsi explorer la fonction de la protéine codée par ce gène en étudiant les conséquences phénotypiques de sa disparition.
Applications en dermatologie :
Maladies infectieuses : recherche de séquences spécifiques de génomes bactériens ou viraux et/ou des ARNm correspondants dans les lésions ou dans les liquides biologiques par HIS (détection spécifique et localisation tissulaire) et PCR (détection très sensible, parfois trop en raison de contaminants possibles). Il faut connaître au moins une partie du génome de l’agent recherché qui doit donc être soupçonné.
Applications : HPV facilement identifié par HIS dans les cellules infectées si le plan de coupe passe par une zone infectée (+ sensible que la recherche des Ag de capside par IHC), en déterminant le(s) type(s) de HPV, oncogène(s) ou non. la PCR a montré les virus dans des lésions tumorales alors que l’HIS était négative (maladie de Bowen, certains carcinomes cutanés).
L’ADN des virus herpès simplex a été trouvé, dans des lésions d’érythème polymorphe post-herpétique. L’HHV8 ou KSV est associé à la maladie de Kaposi, aux lymphomes des cavités naturelles chez les patients atteints de sida et à la maladie de Castleman.
Rétrovirus : HTLV-1, VIH et autres
La présence de l’ARN viral de l’HTLV-1, agent de la leucémie à cellules T de l’adulte, peut être identifiée par RT-PCR dans le sang ou les tissus pathologiques des patients, ainsi que celle du VIH (y compris dans la peau par RT-PCR chez les patients VIH+, notamment dans les cellules de Langerhans).
Mycobactéries : PCR pour la détection de ces bactéries de culture difficile et souvent peu nombreuses dans les lésions (lèpre, tuberculose et mycobactéries atypiques). De nombreux contrôles sont nécessaires (présence de mycobactéries non pathogènes dans l’environnement).
Le diagnostic des lymphomes cutanés T, notamment épidermotropes, est difficile. La biologie moléculaire permet d’affirmer la présence d’un composant monoclonal détectable.
La PCR est complétée par une migration sur gel d’acrylamide avec gradient de dénaturation ou pour étude des hétéroduplex afin de détecter un clone dominant.
La présence d’une bande majoritaire et bien visible signe alors l’existence d’un clone lymphocytaire T qui représente au moins 0,1 à 1,5 % de l’infiltrat.
NB : absence de corrélation systématique entre la présence d’un clone lymphocytaire T dominant au sein d’un infiltrat lymphocytaire, par exemple cutané, et son caractère malin.
La même technique est applicable aux lymphomes B par l’étude des gènes des Ig, mais elle est rarement nécessaire en raison d’arguments importants pour un infiltrat monoclonal B dès le stade de l’immunophénotypage (expression d’un seul type de chaîne légère).
Applications au diagnostic des génodermatoses : Etude des polymorphismes de restriction ou des microsatellites sur l’ensemble de la famille pour montrer des sites polymorphes informatifs, qui suivent la transmission de la maladie dans la famille, ou qui accompagnent le phénotype pathologique quand il n’y a qu’un enfant atteint (maladies récessives).
Un polymorphisme intragénique informatif peut être soit en relation directe avec la mutation pathogène du gène (qui fait disparaître ou apparaître un site de restriction), soit sans signification particulière, expression du polymorphisme physiologique des gènes mais accompagnant le gène pathologique.
Parfois, ce n’est pas la présence ou absence d’un site de restriction qui sert au diagnostic mais les variations de positions relatives de ces sites, qui deviennent visibles dans les grandes délétions ou insertions.
Le profil de restriction de l’individu étudié (fœtus par exemple après biopsie de trophoblaste vers la dixième semaine) est comparé avec celui de l’ensemble de la fratrie y compris le(s) individu(s) atteint(s), ceci pour divers sites informatifs.
On peut alors en déduire avec une très haute probabilité (atteignant 100 % si le site informatif est le même que le site de mutation) la présence ou l’absence du gène muté de façon très précoce.
Une autre technique est représentée par la PCR suivie d’une hybridation utilisant des amorces et des sondes spécifiques des versions normales et mutées du gène en cause ou d’un séquençage direct.
Cette méthode est beaucoup plus directe que la précédente mais nécessite une connaissance préalable précise du gène et de la mutation présente dans la famille étudiée, la séquence de l’ensemble du gène étant souvent très longue.
Ces méthodes diagnostiques s’appliquent à la NF1 / NF2, nævomatose basocellulaire, épidermolyses bulleuses congénitales dystrophiques récessives et jonctionnelles de type Herlitz ainsi que certains types d’ichtyoses.
En diagnostic postnatal, c’est surtout l’étude directe du gène qui est utilisée, soit en recherchant des mutations bien connues sur des « points chauds » (régions d’un gène où les mutations sont particulièrement fréquentes) par différents moyens proches de ceux exposés ci-dessus, ou par étude de l’ensemble du gène (exons et régions flanquantes surtout).
 
On peut également citer la recherche de cellules néoplasiques dans un tissu (sang, ganglion, moelle osseuse, etc) en petit nombre par RT-PCR sur l’ARNm de la tyrosinase pour rechercher des cellules malignes circulantes dans le mélanome ou la PCR avec des amorces spécifiques du réarrangement utilisé par le clone malin dans les lymphomes cutanés.
 
Glossaire :
Acide nucléique : macromolécule constituée d’un enchaînement de nucléotides, enchaînement caractérisé par l’ordre de succession des bases (séquence).
ADNc : ADN complémentaire d’un ARNm correspondant donc à l’ensemble des séquences codantes plus les séquences transcrites mais non codantes.
Amplification : multiplication importante du nombre d’exemplaires d’un fragment d’acide nucléique, en général à des fins d’analyse.
Animal transgénique : animal qui est issu d’un zygote (oeuf fécondé) dans lequel a été introduit un gène (le transgène) différent de ceux des gamètes impliqués dans la fécondation.
Animal knock out (KO) : animal qui est issu d’un zygote dans lequel les deux copies d’un gène précis ont été inactivées.
Apoptose : mort cellulaire programmée.
Banque d’ADN : ensemble de fragments d’ADN artificiellement mis en réserve par inclusion dans les acides nucléiques de vecteurs biologiques (virus par exemple).
Blot : transfert par capillarité de fragments d’acides nucléiques d’un gel d’électrophorèse à une membrane, permettant l’hybridation ultérieure de ces fragments avec une sonde moléculaire au sein de cette membrane ; si fragments d’ADN : southern-blot ; si fragments d’ARN : northern-blot.
Dénaturation : disparition des liaisons faibles unissant les bases complémentaires entre deux fragments d’acides nucléiques (entre deux brins pour l’ADN, au sein d’un même brin pour l’ARN) autorisant la séparation des brins (ADN) ou la disparition des boucles (ARN).
Enzyme de restriction : enzyme qui coupe l’ADN sur des séquences très précises (sites de restriction).
Exon : région d’un gène représentée dans l’ARN messager mature (région codante le plus souvent).
Gène : unité fonctionnelle d’ADN (ensemble de séquences) contenant l’information nécessaire à la production d’un ARN particulier ou d’une protéine particulière ; constitué de régions codantes et non codantes, régulatrices.
Gène suppresseur de tumeur : gène codant pour une protéine dont l’activité est antiproliférative.
Génétique inverse : ensemble des méthodes permettant la localisation puis l’identification d’un gène morbide par étude de la coségrégation de la maladie avec divers marqueurs génomiques (RFLP notamment), au sein de familles atteintes.
Hybridation moléculaire : appariement spécifique et stable de deux fragments d’acides nucléiques par complémentarité de leurs bases se liant deux à deux par des liaisons non covalentes.
Hybridation in situ (HIS) : visualisation directe de la présence, sur une coupe tissulaire, d’un fragment d’ADN ou d’ARN, par son hybridation spécifique avec une sonde marquée qui rend visible le duplex sonde/ADN ou ARN recherché.
Intron : région d’un gène non représentée dans l’ARN messager mature.
Méiose : étape de la différenciation des gamètes au cours de laquelle se produisent des échanges d’ADN entre chromosomes d’une même paire.
Mutation : modification de la séquence de l’acide nucléique support de l’information génétique (ADN en général), par substitution, addition ou disparition des bases composant cette séquence.
Polymerase chain reaction (PCR) : technique d’amplification qui utilise des cycles successifs de dénaturation-polymérisation de l’ADN à l’aide d’amorces complémentaires des extrémités du fragment à amplifier.
Proto-oncogène : gène codant pour une protéine dont l’activité est pro-proliférative. RT-PCR : PCR effectuée sur les ADNc donc précédée de la rétrotranscription reverse des ARNm en ADNc.
Restriction fragments length polymorphism (RFLP) ou analyse du polymorphisme de longueur des fragments « de restriction » : étude par une sonde donnée des fragments issus de la digestion d’un échantillon d’ADN par une enzyme de restriction donnée, permettant de mettre en évidence la variabilité de longueur (polymorphisme) de ces fragments liée à la variabilité des sites de restriction selon les allèles.
Séquençage : analyse directe de la séquence d’un fragment d’ADN.
Sonde moléculaire : fragment d’acide nucléique (ADN ou ARN) complémentaire d’une séquence d’ADN ou d’ARN avec lequel il peut s’hybrider de façon stable et spécifique, permettant la détection, voire l’évaluation de la quantité du fragment spécifiquement reconnu. Traduction : synthèse d’une protéine à partir d’un ARN messager. Transcription : synthèse d’un ARNm à partir de la région codante d’un gène.


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