» Laboratoire de pathologie Colorations standards

Colorations standards


Les coloration en Anathomopathologie
Les colorations en histologie :
 
La Coloration standard : 
 
La coloration des lames permet de mettre en évidence spécifiquement les différentes structures tissulaires et cellulaire. Elle associe toujours un colorant nucléaire (hématéine, hématoxyline) et un colorant cytoplasmique (éosine, érythrosine). On y ajoute souvent un colorant du tissu conjonctif (safran) ce qui réalise une coloration trichromique.
 
B- Procédé opératoire :
1-Coupe déparaffinée et amenée à l’eau ordinaire.
2-Colorer dans l’Hémalun * pendant 3 à 5 minutes
3-Laver dans l’eau ordinaire. En cas de surcoloration, on peut différencier légèrement dans l’alcool chlorhydrique pendant quelques secondes ; puis laver à l’eau. 
4-Bleuir dans une solution aqueuse saturée de carbonate de lithium ou dans une solution ammoniacale faible ( quelques gouttes d’ammoniaque dans l’eau )
5-Laver à l’eau
6-Colorer dans une solution aqueuse à 1% d’Eosine B pendant 5 à 7 minutes
7-Différencier successivement dans les alcools à 70°, puis 95°. Alcool 100°
8-Colorer la lame par le safran en solution alcoolique **pendant 5 à 8 minutes
9 passer dans l’alcool 100°, puis dans le Xylène ( passage dans deux bacs successifs )
10-Monter la lamelle avec de la colle.
 
C résultats
Noyau : bleus à bleu-noir
Cytoplasme : rose vif
Fibres élastiques : rose
Collagène : jaune d’or
 
D Préparation des produits
*Hémalun de Mayer
Solution aqueusesaturée d’alun de potassium ( environ 2 %) ……………………..1.000 mL
Hématéine …………………………………………………………………………. 2 g
Acide Acétique glacial ……………………………………………………………………20 mL
- Faire bouillir la solution d’alun de potassium. Ajouter au liquide bouillant l’hématéine et laisser bouillir encore pendant 5 minutes. Refroidir. Filtrer. Ajouter l’acide acétique. Le produit final est de coloration rouge violacé.
- Conservation 4 à 6 semaine.
** Safran
Faire sécher pendant 24 heures, dans l’étuve à 56°, 2 g de safran du Gâtinais de l’année. Pulvériser au mortier. Ajouter 100 ml d’éthanol absolu. Remettre à l’étuve , en agitant de temps à autres. Le produit est utilisable dès le lendemain. Conservation indéfinie.
 
les colorations Spéciales :
 
Les colorations spéciales sont réalisées pour préciser des structures ou substances difficile à évaluer avec la coloration standard. 
 
La coloration de Perls :
A Principe :
En Milieu acide les Ions ferriques ( Fe+++) réagissent avec le ferrocyanure de potassium en formant un précipité de ferrocyanure ferrique de coloration bleu. Il permet de mettre en évidence l’hémosiderine.
B Procédure Opératoire
Ils sont effectués de préférence sur des pièces fixées dans du formaldéhyde à 10 % tamponné à la neutralité et incluses à la paraffine.
La coupe, déparaffinée, est amenée à l’eau distillée ( réhydratation)
Technique de Lison
1- Placer la coupe dans un mélange de ferrocyanure de potassium et d’acide chlorydrique *pendant 15 à 30 minutes.
2- Rincer soigneusement à l’eau distillée.
3- Coloration des noyaux par le rouge nucléaire.
4- Déshydratation par des bains d’alcools successifs.
5- Clarifier dans deux bac successifs Xylène
6- Monter dans une résine synthétique non oxydante.
Technique de Gomori
1-Placer la coupe dans une solution de ferrocyanure de potassium**. Après 5 minutes, ajouter environ la moitié du volume d’une solution d’acide chlorhydrique en mélangeant bien les deux solutions. Laisser la coupe dans ce mélange pendant 20 à 30 minutes.
2- Laver à l’eau courante
3- Colorer les noyaux par le rouge nucléaire, mais non par le carmin lithiné qui blanchit le bleu de Prusse.
4- Déshydratation par des bains d’alcools successifs.
5- Clarifier dans deux bac successifs Xylène
6- Monter dans une résine synthétique non oxydante.
Technique de Bunting et de Lillie
1- Placer la coupe dans un mélange de ferrocyanure de potassium et d’acide chlorydrique***, soit pendant 30 minute à 60°, soit pendant une heure à la température de la pièce ( en remplaçant le réactif par du réactif frais pendant 30 minutes ).
2- Rincer à l’eau distillée.
3- Colorer les noyaux dans la safranine pendant 2 minutes
4- Laver dans une solution aqueuse à 1% d’acide acétique.
5-Déshydratation par des bains d’alcools successifs.
6- Clarifier dans deux bac successifs Xylène
7- Monter dans une résine synthétique non oxydante
4)Technique de Spicer
1-Placer la coupe dans un mélange de ferrocyanure de potassium et d’acide chlorhydrique **** à 60° pendant 30 minutes.
2-Rincer brièvement dans une solution à 1 % d’acide acétique.
3- Rincer à l’eau distillée.
4- Colorer les noyaux par une coloration au rouge nucléaire.
5- Déshydratation ( passage dans des bacs successifs d’ alcool à 60°, 90° et 100°).
6-.Passage dans 2 bacs successifs de Xylène .
7- Montage de la lamelle avec de la colle
 
C Résultats :
Fer ferrique ( Fe+++) : coloré en bleu à bleu vert de hémosidèrine
Noyaux en rouge.
 
Recommandation pratique et préparation des réactifs :
-Recommandation pratique :
Il est extrêmement important d’utiliser des réactifs purs , « pour analyse »et dépourvus de toutes trace de fer. Aucun instrument contenant du fer ne sera utilisé pour tenir les coupes.
-Les réactifs :
Quel que soit leur mode de préparation , les mélanges de ferrocyanure de potassium et d’acide chlorhydrique ( ou acétique ) doivent être préparés immédiatement avant l’emploi et avoir une coloration jaune claire.
*La solution de Lison :
Mélanger extemporanément à parties égales :
Solution aqueuse à 2 % de ferrocyanure de potassium, fraîchement préparée.
Solution aqueuse à 2 % d’acide chlorhydrique.
**La solution de Gomori
  - Utiliser d’abord :
Solution à 5 ou 10 % de ferrocyanure de potassium, fraîchement préparée.
Ajouter àpres 5 minutes :
Solution aqueuse à 10% d’acide chlorhydrique.
***Solution de Bunting et Lillie :
Mélanger extemporanément, à parties égales :
Solution aqueuse à 2 % de ferrocyanure de potassium, fraîchement préparée.
Avec solution aqueuse à 2% d’acide chlorhydrique ( Bunting ) ou Solution aqueuse à 5 % d’acide acétique ( Lillie )
****Solution de Spicer
Mélanger extemporanément, à parties égales :
Solution aqueuse à 1% de ferrocyanure de potassium fraîchement préparée.
Solution aqueuse à 1% d’acide chlorhydrique. 
 
Le PAS  : Réaction de L’Acide Périodique de Schiff 
 
Principe :
Un agent oxydant, l'acide périodique, rompt les liaisons entre 2 carbones de certains groupes chimiques ( groupe glycol-1-2, hydroxy-1 amino-2 alkylomino-2 et hydroxy-1 céto-2 ) en faisant apparaître des aldéhydes. Ces aldéhydes sont visibles par le réactif de Schiff ( fuchsine basique décolorée par l'acide sulfureux ) qui forme avec eux un produit de condensation rouge. Cette coloration permet de mettre en évidence les mucines, le glycogène, les filaments et spores mycéliens
 
Procédure opératoire : `
La coupe, déparaffinée, est amenée à l'eau distillée
1- Placer dans une solution d'acide périodique* pendant 5 minutes 
2- Laver à l'eau courante pendant 5 à 10 minutes puis passer dans de l'eau distillée . 
3- Placer dans le réactif de Schiff **pendant 15 à 30 minutes. 
4- Rincer dans 3 bains successifs d'acide sulfureux***fraîchement préparé, de 2 minutes chacun
5- Laver à l'eau courante pendant 2 à 5 minutes 
6- Eventuellement une coloration de fond 
7- Déshydratation ( passage dans des bacs successifs d’ alcool à 60°, 90° et 100°).
8-.Passage dans 2 bacs successifs de Xylène .
9- Montage de la lamelle avec de la colle
 
Résultats 
Substance réactive colorée en rouge-violacé des mucines neutres et des éléments mycéliens.
  
Préparation des Produits
* Acide Périodique
Une solution aqueuse à 0,5 ou 0,8 % d’acide périodique
** Réactif de Schiff :
Dissoudre : Fuschsine basique ( pararosaniline ) ……. ...1 g
Dans de l’eau distillée bouillante ……………………..200 mL
Agiter fortement. Refroidire à 50°. Filtrer
Ajouter au filtrat : HCL 1 N……………………………………20 mL
Refroidire à 25°
Ajouter : métabisulfite de sodium ( ou de potassium ) 1 g
Laisser reposer, à l’obscurité pendant 24 heures, dans un flacon parfaitement nettoyé et bien fermé.
Ajouter : charbon activé ………………………………2 g
Agiter et filtrer rapidement. Le filtrat ( réactif de Schiff) doit être parfaitement incolore et limpide. Conserver à l’obscurité, en flacon brun, au réfrigérateur. 
 
Remarque 
Il est courant d’y associer la diastase (PAS-diastase) qui digère le glycogène. Il ne persistera alors qu’une coloration rosée des mucines intra ou extracellulaires.
Pour les cas de tumeurs indifférenciées, cette coloration est utile pour orienter le diagnostic vers une origine glandulaire.
 
B Procédure opératoire :
La coupe déparaffinée, est amenée à l’eau distillée 
1- Mettre la lame recouverte d’amylase salivaire en chambre humide à l’étuve à 37°C : 30 minutes
2- rincer en eau distillée
3- Effectuer un PAS en suivant le mode opératoire si dessus 
 
 
Le bleu Alcian ou Le bleu Astra  
 
Principe 
Fixation du Bleu Alcian ou du bleu Astrsur sur les groupes acides des MPS et en particulier l’acide hyaluronique.
 
Procédure
La coupe, déparaffinée, est amenée à l'eau 
1-Coloration dans une solution de bleu Alcian à 0,1 % dans l’acide acétique glacial dilué à 3% (ph 2,4 à 2,6%) pendant 20 minutes .
ou Coloration dans une solution de bleu Astrat à 1 % dans l'acide acétique à 1% pendant 5 à 10 minutes 
2- Rincer dans l'eau distillée. 
3- Colorer les noyaux par le rouge nucléaire 
5- Déshydratation ( passage dans des bacs successifs d’ alcool à 60°, 90° et 100°).
6-.Clarifier en passant dans 2 bac successifs de Xylène .
7- Montage de la lamelle avec de la colle
 
Résultats 
Colorant des mucines acides en bleu turquoise.
 
Le rouge Congo  
 
Principe 
Fixation du Rouge Congo sur la substance amyloïde, vraisemblablement liée à la configuration linéaire, orientée de cette substance.
 
Procédé Opératoire :
 Méthode au Rouge Congo Alcalin de Puchtler, Sweat et Levine ( méthode la plus spécifique )
 
Il est applicable de préférence à des pièces fixées dans le formol à 10% neutralisé.
La coupe, déparaffinée, est amenée à l’eau
1-Colorer dans Hématoxyline pendant 2 à 3 minutes
2-Différencier en Alcool acétique à 5 % : 1 passage
3-Rincer dans 3 bains successifs d’eau distillée.
4- Transférer dans une solution d’éthanol saturée de chlorure de sodium* 
5- Colorer dans la solution alcoolique alcaline de rouge Congo ** pendant 20 minutes.
6- Déshydratation ( passage dans des bacs successifs d’ alcool à 60°, 90° et 100°).
7-.Clarifier en passant dans 2 bacs successifs de Xylène .
8- Montage de la lamelle avec de la colle
 
C Résultats : 
-Substance amyloïde rose vif à rouge 
-Examen au microscope polarisant : forte biréfringence et dichroïsme 
 
D Préparation des Produits :
 
 
*Solution d’éthanol alcalin :
A : Ethanol à 80% saturé de chlorure de sodium ……………………… 50 mL
Ajouter : solution aqueuse à 1% de soude ………………………………………0.5 mL
Filtrer
Utiliser immédiatement ( moins de 15 minutes après la préparation )
 
**Rouge Congo alcalin :
Solution mère :
Ethanol à 80% saturé de rouge Congo et de chlorure de sodium
Solution de travail 
-Au moment de l’emplois, ajouter à 50mL de solution mère :
0,5 mL d’une solution aqueuse à 1% de soude.
-Filtrer. La solution doit être utilisée dans les 15 minutes suivant sa préparation.
 
La fluorescence par la thioflavine   
 
Principe : Fixation de la Thioflavine T sur la substance amyloïde, donne une fluorescence blanc verdâtre en lumière polarisée 
 
Procédé opératoire : 
Pièce fixée au formole à 10% neutre ( pendant un temps assez court pour éviter une autofluorescence tissulaire du fond ) ou dans un fixateur usuel. 
La coupe déparaffinée est amenée à l'eau 
1- Coloration éventuelle dans l'hémalun , pendant 2 minutes, sans différencier ensuite 
2- Laver à L'eau
3- Coloration dans une solution aqueuse à 1 % de Thioflavine T fraîchement filtrée pendant 3 minutes 
4- Différencier dans une solution aqueuse à 1% d'acide acétique, pendant 10 minutes 
5- Rincer à l'eau 
6- Monter dans la glycérine tamponnée à pH 7 dans un mélange glycérine-solution aqueuse de chlorure de sodium à 0,9% ou mieux dans un sirop d'Apathy
 
C Résultats 
Substance amyloïde prend une fluorescence blanc verdâtre, légèrement plus brillante dans les amyloses primitives et secondaires.
 
L’orcéine
 
Principe
Coloration des fibres et lame élastiques par un colorant acide faible l’orcéine, qui se fixe avec une grande électivité ( mais non une spécificité absolue ) sur ces éléments.
 
Procédure Opératoire
La coupe, déparaffinée, est amenée à l’eau.
1-Colorer à l’orceine pendant 30 à 60 minutes .
2-Rincer à l’eau distillée.
3-Essuyer l’eau en excès et plonger dans l’alcool à 95° pour enlever l’excès de colorant.
4-Transférer dans l’alcool absolu pendant 5 à 30 minutes, jusqu’à ce que la coupe soit brun pâle .
5-Décolorer le fond, jusqu’à ce que la coupe soit presque incolore, dans l’acide alcool. La coloration est obtenue en 2 à 10 minutes.
6- Laver dans l’eau courante pendant au moins 5 minutes.
7- Déshydrater dans l’ alcools à 95° puis absolu.
8-Clarrifier en passant dans deux bains successifs de Xylène.
9-Montage de la lamelle avec de la colle. 
 
C Résultats :
Lames élastiques brun noire . 
 
L’argentation
 
Principe :
L’ imprégnation argentique est le procédé habituel de mise en évidence des fibres réticulaires. Elle est basée sur l’emploi usuel d’argent instable ( nitrate d’argent ammoniacal en général ) et d’un réducteur (formol le plus souvent ) : celui-ci réduit le sel d’argent en argent métallique noir qui se dépose avec une grande électivité sur les fibres réticulaires. Cette méthode caractérise « l’argyrophilie » de ces fibres.
Précaution général :
La réussite de cette coloration nécessite le respect scrupuleux d’un certain nombre de règles.
-N’employer que des produits chimiquement purs.
-Utiliser de l’eau bidistillée, et non simplement distillée.
-Se servir d’une verrerie d’une très rigoureuse propreté.
-Eviter les poussières qui altèrent les solutions.
-Ne jamais mettre d’objet métallique au contacte des solutions.
 
Procédé opératoire : Selon la méthode de Gomori
Fixation dans du formol à 10 %.
La coupe, déparaffiné, est amenée à l’eau .
1- Oxyder dans une solution aqueuse à 0,5% de permanganate de potassium pendant 1 minute.
2- Laver à l’eau pendant 2 minutes .
3- Différencier dans une solution aqueuse à 2% de métabisulfite de potassium pendant 1 minute.
4- Laver à l’eau pendant 2 minutes .
5- Sensibiliser dans une solution aqueuse à 2 % de sulfate de fer et d’ammonium pendant 1 minute.
6- Laver à L’eau courante pendant 2 minutes, puis dans 2 bains d’eau distillée de 30 secondes chacun
7- Imprégner dans une solution de nitrate d’argent ammoniacal* pendant 1 minute.
8- Rincer à l’eau distillée pendant 20 secondes .
9- Réduire dans une solution aqueuse à 20 % de formaldéhyde, pendant 3 minutes.
10- Laver à l’eau pendant 3 minutes.
11-Virer dans une solution aqueuse à 0,2% de chlorure d’or , pendant 10 minutes.
12- Rincer à l’eau distillée .
13- Passer dans une solution aqueuse à 2% de métabisulfite de potassium pendant 1 minute.
14-Fixer dans une solution aqueuse à 2% d’hyposulfite de sodium, pendant 1 minute.
15- Laver à l’eau pendant 1 minute.
16- Déshydrater ( passage dans des bacs successif d’ alcool à 60°, 90° et 100°).
17-Clarrifier en passant dans deux bains successifs de Xylène.
18-Montage de la lamelle avec de la colle. 
 
Résultats 
Fibres de réticuline : en noir intense
 
Préparation du réactif
*nitrate d’argent Ammoniacal.
A 10 mL d’une solution aqueuse à 10 % de nitrate d’argent
Ajouter 2 à 2,5 mL d’une solution de potasse à 10 %,
Puis de l’ammoniaque à 26-28% ,goutte à goutte, en agitant continuellement le récipient jusqu’à ce que le précipité ait complètement disparu.
Verser avec précautions, goutte à goutte, la solution de nitrate d’argent , jusqu’à ce que le précipité qui se forme disparaisse aisément en agitant la solution.
A ce moment, diluer de moitié la solution avec de l’eau distillée.
 
 
La coloration de Fontana Masson :
Principe :
Précipitation d’argent métallique, noir, aux dépens de solutions de sels d’argent, sous l’influence de substance réductrice( pigment ) comme la mélanine, les lipofuscines, la bilirubine.
 
Procédé opératoire :
La coupe ,déparaffinée, est amenée à l’eau
1- Traiter par la solution iodée de Gram* pendant 10 minutes. 
2- Laver à fond l’eau distillée ( 15 minutes à 2 heures ).
3- Plonger la coupe dans une solution de nitrate d’argent ammoniacal de Fontana **, dans un récipient couvert et à obscurité pendant 18 à 24 heures.
4- Rincer à l’eau distillée
5- Virer dans une solution à 0,1 % de chlorure d’or pendant 4 minutes.
6-Rincer à l’eau distillée
7-Fixer dans une solution à 5% d’hyposulfite de sodium pendant 2 minutes.
8-Passer de l’eau puis effectuer une coloration nucléaire par du rouge nucléaire, pendant 5 minutes.
9- Déshydrater ( passage dans des bacs successifs d’ alcool à 60°, 90° et 100°).
10-Clarrifier en passant dans deux bains successifs de Xylène.
11-Montage de la lamelle avec de la colle.
 
Résultats :
Substance réductrice colorée en noire ( mélanine, lipofuscines, bilirubine )
D Préparation des produits :
*Solution de Gram :
Iode ……………………………………………………………………………………1 g
Iodure de potassium ………………………………………………………………… .2 g
Eau distillée…………………………………………………………………………300 mL
 
**Solution de Fontana :
A 20 mL de nitrate d’argent à 10 %
Ajouter de l’ammoniaque concentré, goutte à goutte en remuant constamment, jusqu'à ce que le précipité qui s’est d’abord formé se soit presque complètement redissous ( il ne doit rester que quelques très fines granulations )
Ajouter alors 20 mL d’eau distillée.
Laisser reposer 24 heures .
Décanter dans un flacon sombre
La solution ainsi préparée se conserve environ 1 mois .
 
L’argentation de Grocott
A principe : Application à la détection des champignons de la méthode Gomori à l’argentation méthénamine. 
B Procédé Opératoire :
Pièces fixées dans le formole à 10%,
Incluses et coupées dans la paraffine .
la coupe, déparaffinée , est amenée à l’eau distillée.
1- Oxyder dans une solution aqueuse à 5 % d’acide chromique pendant une heure .
2-Laver quelques secondes à l’eau courante
3-Laver dans une solution aqueuse à 1% de bisulfite de sodium pendant 1 minute
4-Laver à l’eau courante pendant 5 à 10 minutes
5-Laver dans 3 à 4 bains d’eau distillée
6-Placer dans la solution d’argent-méthénamine*, à l’étuve à 58 °, pendant 30 minutes à 60 minutes, jusqu’à ce que les coupes aient pris une coloration brun-jaunâtre .
7-Retirer la préparation de cette solution en utilisant une pince paraffinée et la plongée dans l’eau distillée. Vérifier au microscope si l’imprégnation est suffisante ( les champignons doivent êtres colorés en brun foncé).
8-Rincer dans 6 bains successifs d’eau distillée
9-Virer dans une solution aqueuse à 0.1% de chlorure d’or, pendant 2 à 5 minutes.
10-Rincer à l’eau distillée
11-Eliminer l’argent non réduite en passant une solution aqueuse à 2 % d’hyposulfite de sodium , pendant 2 à 3 minutes
12-Laver énergiquement à l’eau
13-Colorer le fond par une solution de vert lumière **pendant 30 à 45 secondes
14-Déshydrater ( passage dans des bacs successif d’ alcool à 60°, 90° et 100°).
15-Clarrifier en passant dans deux bains successifs de Xylène.
16-Montage de la lamelle avec de la colle. 
 
Résultats :
Champignons : noir intense
Fond : vert pâle
Mucine : gris foncé
 
Préparation des produits :
* Argent-méthénamine
Solution Mère :
-Mélanger :
Solution aqueuse à 3% d’héxaméthylènetétramine  ……………………….100 mL
Solution aqueuse à 5% de nitrate d’argent ……………………………………...5 mL
Il se forme un précipité blanc qui se dissout immédiatement par agitation. Cette solution se conserve pendant un mois au réfrigérateur.
Solution de travail :
-Mélanger au moment de l’emplois :
Solution aqueuse à 5% de borax …………………………………………….. .2 mL
Eau distillée ……………………………………………………………………….25 mL
Et après dissolution :
Solution mère d’argentométhénamine……………………………………………… 25 mL
 
** Vert lumière :
Solution mère :
Vert Lumière SF ………………………………………………………………………0 ,2 mL 
Eau distillée ……………………………………………………………………...100 mL
Acide acétique glacial ………………………………………………………………..0.2 mL
Solution de Travail :
Solution mère………………………………………………………………………….10 mL
Eau distillée …………………………………………………………………………...50 mL
 
 
 
les colorations en cytologie :
Les colorations standards : 
 
La coloration PAPANICOLAOU (coloration nucléaire et cytoplasmique)
Elle est surtout utilisée pour les frottis gynécologiques, mais elle peut s’appliquer sur tout type de prélèvement sauf pour l'hématologie où elle n’est pas recommandée. Elle impose une fixation préalable (Alcool éther, SEDFIX, laque).
Principe 
Association d'une coloration nucléaire par l'hématoxyline de Harris et d'une coloration cytoplasmique par l'orange G et un mélange composé essentiellement de vert lumière, de brun Bismarck et d'éosine ( mélange polychrome « EA50 » Papanicolaou ). 
 
Le Procédé Opératoire 
1- Plonger successivement dans des alcools à 80°,70°, à 50° puis dans l'eau distillée : 30 secondes dans chaque bain. 
2- Colorer à l'hématoxyline de Harris pendant 3 à 6 minutes. 
3- Rincer à l'eau distillée. 
4- Plonger à 6 reprises dans une solution d'acide chlorhydrique à 0,25 %.
5- Laver dans l'eau courante (6 minutes) puis dans l'eau distillée ( 30 secondes).
6- Passer successivement dans les acooles à 50°, 70°, 80° et 95° : 30 secondes dans chaque bains
7- Colorer dans une solution d'orange G * pendant 90 secondes . 
8- Plonger dans 2 bains successifs d'alcool à 95°, de 30 secondes chacun.
9- Colorer dans le mélange polychrome « EA50 de Papanicolaou »**pendant 90 secondes.
10- Plonger dans 3 bains successifs d'alcool à 95°, de 30 secondes chacun puis dans l'alcool absolu. 
11- Passer dans un mélange xylène-alcool absolu ( 1:1) puis dans le xylène
12-Monter dans une résine neutre. 
 
Résultats 
Noyaux : colorés en gris-bleu ou violet 
Cytoplasme des cellules éosinophiles : en rouge-rose ou orange ; les cellules cyanophiles : en bleu clair, parfois verdâtre. 
 
Préparation des Produits
*Orange G
Solution d’orange G à 0.5% dans l’éthanol à 95% ……………………………100 mL
Acide phosphotungstique …………………………………………………………0,015 g
**Le Mélange polychrome « EA50 » de Papanicolaou :
Nous indiquons la composition, bien qu’on utilise en routine une solution toute préparée du commerce.
Vert lumière jaunâtre ……………………………….0,375 g
Brun Bismarck ………………………………………..0,4 g
Eosine jaunâtre ……………………………… ……….2,5 g
Eau distillée ……………………………………….50 mL
Ethanol à 96° ………………………………………609 g
Méthanol absolu ……………………………. 160 g
Solution d’acide phosphotungstique
dans de l’éthanol à 50% (1, 7 g pour 5 mL) ……………..5 mL
Solution saturée de carbonate de lithium ……… .0,5 mL
Acide Acétique glacial ………………………………….1 mL 
 
 
La coloration de May-Grunwald-Giemsa (MGG)utilisée en hématologie
 
Principe :
 Coloration faisant agir successivement deux « colorants neutres »
-Le mélange de May-Grunwald , éosinate de bleu de méthylène qui colore les noyaux en bleu et les cytoplasmes basique en rouge.
Et le colorant Giemsa, mélange complexe de bleu de méthylène et d’éosinate d’azur et de violet de méthylène, qui colore les noyaux en rouge violacé, les cytoplasmes en bleu ou rose suivant les cellules et les éléments azurophiles en rouge pourpre intense.
 
Procédé opératoire :
La coupe déparaffiné est amenée à l’eau.
1- Passer dans le lugol* pendant 5 minutes
2- Puis dans une solution aqueuse à 5 % d’hyposulfite pendant 5 minutes
3- Laver à l’eau distillée.
4- Placer dans le colorant de May-Grunwald**,dilué extemporanément (1 mL pour 4 mL d’eau distillée) pendant 15 minutes à l’étuve à 37°
5- Sans laver, placer dans le colorant Giemsa** dilué ( 3 gouttes pour 2ml d’eau distilée) pendant 40 minutes à l’étuve à 37 °
6- Laver à l’eau distillée.
7- Différencier dans l’eau acétique (5 gouttes pour 100mL).
8- Laver de nouveau dans l’eau distillée. Essorer au papier filtre.
9-Déshydrater dans un mélange à parties égales éthanol absolu-acétone.
10-Clarrifier en passant dans deux bains successifs de Xylène.
11-Montage de la lamelle avec de la colle
 
Résultats :
Noyaux : rouge –violet et rose si la coloration est parfaitement réussie
Cytoplasme basophile : du bleu ciel au bleu foncé ; acidophile : rouge clair ou rosé ; polychromatophiles : grisâtre ou violacé.
 
D Préparation des Produits
*Lugol
Iode ………………………………………………………………1 g
 
Iodure de potassium…………………………………………………2 g
Eau distillée ……………………………………………………100 mL
 
**Colorants de May-Grunwald et de Giemsa ,
On ne les prépare pas soi-même , on utilise des solutions commerciales.
 
La coloration Harris-Shorr
Principe :
C’est association d’une coloration nucléaire par l’hématoxyline de Harris et d’une solution de Shorr « S 3 » qui est l’association d’une coloration nucléaire par le Biebrisch Scarlet et une coloration cytoplasmique par le fast green FCF et l’orange C.
Procédé Opératoire :
1-Plonger le frottis à 10 reprises dans l’éthanol à 70°
2-Plonger à dix reprises dans l’eau distillée.
3- Colorer à l’hématoxyline de Harris pendant 90 seconde à 2 minutes
4- Rincer à l’eau courante
5-Passer dans une solution saturée de carbonate de lithium pendant 30 secondes
6-Plonger à dix reprises dans l’eau distillée
7-Plonger à dix reprises dans l’éthanol à 70° 
8-Plonger à dix reprises dans l’éthanol à 95°
9-Colorer dans la solution de Shorr « S 3 »* pendant 4 à 6 minutes
10- Plonger à dix reprises dans l’éthanol à 95°
11-Plonger à dix reprises dans un premier bain d’éthanol absolu, puis dans un deuxième bain.
12 Passer dans le Xylène pendant 30 secondes
13-Montage de la lamelle avec de la colle. 
 
C Résultats :
Noyaux non picnotiques : Bleu violet, picnotiques : violet brillant
Cytoplasme des cellules éosinophiles : rouge orangé brillant ; cyanophiles : vert foncé ( cellules jeunes ) ou vert pâle ( cellules mature )
 
D Préparation du produit :
* Solution Shorr « 3S »


Il est préférable d’utiliser une solution commerciale toute préparée.



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