» obstétrique Diagnostic pré-implantatoire

Diagnostic pré-implantatoire


Diagnostic pré-implantatoire (DPI) : Dès 1990, un diagnostic de sexe était réalisé par PCR sur les embryons de couples susceptibles de transmettre une maladie génétique récessive liée à l’X ; seuls les embryons femelles étaient transférés dans l’utérus maternel. Dès 1992, DPI de mucoviscidose par étude de la mutation deltaF508.
Le DPI est un diagnostic génétique sur 1 ou 2 cellules d’un embryon en comportant six à huit, avant son transfert in utero. Il se fait sur plusieurs embryons pour sélectionner ceux indemnes de l’affection redoutée, provenant d’une FIV avec micro-injection de spermatozoïdes (ICSI).
Les couples concernés par le DPI ont une histoire d’interruption médicale de grossesse suite à un diagnostic prénatal et/ou un ou plusieurs enfants gravement atteints ou décédés.
Elle s’adresse le plus souvent à des couples fertiles ayant déjà obtenu une ou des grossesses spontanément. Le choix des techniques de laboratoire (biopsie, techniques de cytogénétique ou génétique moléculaire) et la stratégie de transfert embryonnaire sont importants pour la qualité du DPI et l’amélioration des chances de grossesse, tout en diminuant les contraintes du biologiste responsable du diagnostic définitif.
Le DPI est autorisé, en France, par la loi n ° 94-654 du 29 juillet 1994, relative au don et à l’utilisation des éléments et produits du corps humain, à l’assistance médicale à la procréation et au diagnostic prénatal. Les conditions sont restrictives :
–médecin exerçant son activité dans un centre de diagnostic prénatal pluridisciplinaire qui atteste que le couple, a une forte probabilité de donner naissance à un enfant atteint d’une maladie génétique d’une particulière gravité, incurable au moment du diagnostic ;
– identification préalable, chez l’un des parents, de l’anomalie (ou les anomalies) responsable(s) de cette maladie ;
– les 2 membres du couple écrivent leur consentement au DPI ;
– le DPI n’a pour but exclusif que de rechercher l’affection ;
À ce jour, en France, trois centres sont agréés (Strasbourg, Paris, Montpellier).
Le DPI implique une FIV avec ICSI pour obtenir plusieurs embryons ensuite soumis à l’analyse monogénique ou chromosomique.
Consultation de conseil génétique : atteste la pertinence du DPI, et confirme, si besoin, le diagnostic. Membre d’un centre pluridisciplinaire de diagnostic prénatal, le généticien reprend avec le couple son histoire personnelle et familiale, dresse l’arbre généalogique, évalue le risque de récurrence pour la maladie concernée selon les antécédents (avortements spontanés, nombre d’enfants vivants malades), envisage avec le couple d’autres solutions (diagnostic prénatal, don de gamètes, adoption), en particulier si le DPI n’est pas réalisable.
Le dossier de chaque couple est discuté en RCP. Une attestation du centre multidisciplinaire de diagnostic prénatal est délivrée pour tous les couples dont l’indication de DPI est retenue.
La FIV avec ICSI permet d’obtenir plusieurs embryons en vue d’établir leur statut génétique, afin de ne transférer que le ou les embryons sains.
Une cohorte suffisante d’embryons assure la présence d’au moins 1 embryon sain.
La nécessité d’obtenir plusieurs embryons est due à : la corrélation entre la pathologie héréditaire et le nombre d’embryons non atteints, perte de matériel entre la ponction ovocytaire et le transfert embryonnaire (< 50 % des ovocytes recueillis donneront des embryons à biopsier), l’influence du nombre d’embryons transférés sur le taux de grossesses.
Annulation des cycles avec < 6 follicules, entre 6 et 8, l’annulation doit être débattue avec le couple.
L’âge de la patiente est un facteur prédictif majeur de bonne réponse à la stimulation de l’ovulation.
Les dosages hormonaux à J3 du cycle menstruel (FSH, LH, œstradiol) évaluent le potentiel de réponse ovarienne à la stimulation.
L’évaluation de la cavité utérine se fait par hystérosalpingographie et/ou par hystéroscopie.
Le partenaire est également exploré par un spermogramme associé à un spermocytogramme, même si l’ICSI est la technique de choix pour réaliser un DPI.
 
Le choix du protocole, des produits et de leur posologie dépend de l’âge de la patiente, de son bilan hormonal à J3 du cycle, de son indice de masse corporelle et, des antécédents de réponse ovarienne à des protocoles antérieurs de stimulation de l’ovulation.
Hors cas particuliers, les protocoles longs associant agoniste de la GnRH et FSH sont retenus compte tenu de leur performance et de la possibilité de programmation.
En effet, la programmation est essentielle car la réalisation d’un DPI mobilise toute une équipe indissociable à un moment donné (biologiste, clinicien, généticien).
Afin d’éviter toute contamination via les spermatozoïdes fixés sur la zone pellucide, l’ICSI est la technique de choix pour un DPI.
La PCR, en particulier sur une ou deux cellules, nécessite des précautions drastiques.
Il s’agit d’éviter toute contamination par de l’ADN extérieur : celui des divers opérateurs et intervenants, l’ADN volatile des PCR antérieures, celui des cellules du cumulus oophorus ou des spermatozoïdes qui peuvent contaminer le prélèvement de blastomères si le ou les embryons ont été obtenus en fécondation in vitro classique.
Les spermatozoïdes sont sélectionnés sur un gradient de densité, puis lavés, le culot obtenu est resuspendu en milieu de culture, puis préparation déposée dans l’incubateur à CO2 jusqu’au moment de la micro-injection.
Les ovocytes recueillis sont mis en milieu de culture. Les cellules du cumulus sont dissociées après incubation des ovocytes durant 1 minute dans un milieu de culture contenant de la hyaluronidase (2 %, 30 secondes). Les cellules du cumulus sont retirées par aspiration-refoulement des ovocytes dans une micropipette en verre. Ensuite, les ovocytes sont observés au microscope inversé. L’aspect morphologique et la maturité nucléaire sont notés. Seuls les ovocytes matures (métaphase II) ayant expulsé leur 1er globule polaire sont micro-injectés.
Une fois les 2 micropipettes (contention et injection) placées sur le micromanipulateur, l’injection d’un spermatozoïde dans l’ovocyte s’effectue en microgouttes sous huile de paraffine à l’aide de deux micropipettes :
– une de contention (holding) pour maintenir l’ovocyte pendant l’injection proprement dite ;
– l’autre d’injection utilisée pour immobiliser et aspirer le spermatozoïde, puis l’injecter dans le cytoplasme de l’ovocyte.
Les ovocytes injectés sont remis en milieu de culture à 37 °C sous 5 % de CO2.
La fécondation est observée 18 à 22 heures post microinjection par l’apparition des deux pronuclei et l’expulsion du second globule polaire.
La biopsie embryonnaire se fait 72 heures après la micro-injection.
Les embryons sont en général au stade de six à huit cellules.
Avant le début de la biopsie, l’examen des embryons est réalisé en présence du biologiste (cytogénéticien ou généticien moléculaire) responsable du diagnostic.
La décision du nombre de blastomères à prélever pour chaque embryon est prise en commun.
La biopsie embryonnaire nécessite de créer une perforation dans la zone pellucide qui peut être faite soit par le tyrode acide, soit au laser.
Ensuite, un ou deux blastomères sont aspirés par la micropipette d’aspiration.
Le (ou les) blastomère(s) isolé(s) est (sont) mis à la disposition du biologiste responsable du diagnostic.
L’embryon biopsié est immédiatement remis en culture.
Il est important de visualiser le noyau du blastomère sélectionné en présence des biologistes responsables de l’analyse génétique.
Une photographie du blastomère est prise.
La biopsie embryonnaire sera répétée autant de fois qu’il y a d’embryons prêts à être prélevés.
La viabilité de l’embryon biopsié est notée.
Les embryons indemnes de la maladie sont ensuite transférés in utero au troisième ou quatrième jour postfécondation.
Le nombre d’embryons à transférer est discuté avec le couple avant de réaliser le geste lui-même afin de leur offrir un maximum de chances de réussite tout en limitant le risque de grossesses multiples.
Le transfert embryonnaire à j4 ne montre pas d’effet délétère alors qu’il existe, non seulement une plus grande sécurité au diagnostic génétique mais aussi une possibilité d’augmenter le nombre de recherches du fait du temps imparti au biologiste.
Cytogénétique et DPI : Les déséquilibres chromosomiques sont, chez l’homme, la cause principale des anomalies de la reproduction (avortements spontanés précoces, infertilité), des malformations congénitales et des retards mentaux (aneuploïdies, anomalies de structure chromosomique), de risque de survenue élevé si liées à une anomalie chromosomique équilibrée chez l’un des membres du couple ou si l’âge maternel est élevé.
La FISH montre des déséquilibres chromosomiques dans les noyaux de cellules en interphase.
 
Les blastomères sont fixés sur lame de verre avant l’hybridation in situ, lyse du cytoplasme par (HCl/Tween) ou (méthanol/acide acétique précédé d’un choc au citrate de sodium/BSA), dont les restes sont éliminés dans un bain de pepsine puis fixation du noyau.
 
La technique FISH détermine partiellement le contenu chromosomique d’un noyau. Le principe repose sur l’hybridation d’un fragment d’ADN (sonde) spécifique d’une région chromosomique et marqué par des nucléotides couplés à un fluorochrome, sur l’ADN de chromosomes interphasiques préalablement dénaturés. La sonde est visualisée par le signal émis par le fluorochrome et apparaît sous forme d’un signal fluorescent. Les sondes chromosomiques sont déposées sur la zone préalablement délimitée par un gravage au diamant permettant de localiser le blastomère.
Une lamelle est ensuite scellée avec du rubber cement puis une codénaturation est réalisée (69 °C, 5 à 7 minutes) permettant la dénaturation simultanée de l’ADN du noyau et des sondes.
Les lames sont ensuite mises à l’étuve (37 °C) pour une durée d’hybridation variable (2 à 3 heures pour les sondes centromériques et 16 heures pour les sondes télomériques).
 
Une fois l’hybridation terminée, une série de lavages est réalisée. Puis, avec 1 microscope à épifluorescence muni de filtres spécifiques, les signaux d’hybridation sont observés et interprétés.
 
On recommande de prélever et d’analyser indépendamment 2 blastomères du même embryon, ce qui augmente la fiabilité du diagnostic lorsque les résultats de l’analyse des 2 cellules sont concordants. Le diagnostic doit être fait dans les 12 à 48 heures après biopsie, pour transférer les embryons indemnes dans l’utérus maternel le plus rapidement possible pour ne pas compromettre leur viabilité. Il faut exclure absolument toute contamination (cellules folliculaires d’origine maternelle entourant l’ovocyte, et un ou plusieurs spermatozoïdes restés accrochés à la zone pellucide de l’embryon lors de la procédure de FIV, autres contaminations par le matériel ou des tests précédents) vu que l’on ne travaille que sur 1 seule cellule d’où nécessité d’un grand nombre de cycles
 
Diagnostic de sexe (FISH avec sondes spécifiques des chromosomes X et Y) : réalisé chez des couples à risque de transmettre une pathologie récessive liée au chromosome X, lorsque celui-ci ne peut pas être réalisé par les techniques de biologie moléculaire. Si le gène est connu avec mise au point unicellulaire, on peut réimplanter les embryons masculins indemnes de la maladie.
Si diagnostic en FISH, seuls les embryons XX (féminins) seront transférés, puisque un embryon masculin sur deux est à risque de transmettre la maladie. Mais : technique rapide (3 heures) identifiant les embryons féminins, mais également les embryons 45X (syndrome de Turner) ou 47XXX, contrairement à la PCR qui ne permet pas de réaliser ces diagnostics.
Translocations :
– Robertsoniennes (fusion centromérique de deux chromosomes acrocentriques : chromosomes 13, 14, 15, 21 et 22) ;
– réciproques (échanges de segments chromosomiques entre 2 chromosomes).
Le but du DPI est de sélectionner les embryons sains ou porteurs équilibrés de la translocation.
L’individu du couple porteur de telles translocations peut avoir une ségrégation méiotique déséquilibrée des chromosomes impliqués dans la translocation, qui sera alors responsable d’un embryon porteur d’une aneuploïdie (monosomie ou trisomie).
Pour les translocations réciproques, le risque de déséquilibre chromosomique est fonction des chromosomes impliqués et de la localisation des points de cassure, et est donc caractéristique de chaque translocation.
Chaque couple porteur d’une translocation réciproque constitue un cas particulier pour lequel les risques de survenue dans la descendance de déséquilibre partiel doivent être établis de façon spécifique.
De tels diagnostics impliquent une mise au point longue, car la plupart du temps il est nécessaire de fabriquer des sondes spécifiques des points de cassure de la translocation.
Le diagnostic des anomalies de nombre correspond à certaines indications comme le syndrome de Klinefelter, la trisomie X, ou un double Y.
Les recherches d’aneuploïdie proposées pour âge maternel élevé (> 38 ans), avortements spontanés à répétition, échecs répétés de FIV, ou choix du sexe par convenance sont interdites en France mais proposées dans d’autres centres.
Indications de DPI en biologie moléculaire :
– maladies monogéniques autosomiques récessives, dominantes pour lesquelles l’anomalie moléculaire peut être détectée grâce aux techniques de la biologie moléculaire ;
– maladies liées au chromosome X avec diagnostic par biologie moléculaire.
Si ce dernier est impossible, un diagnostic de sexe peut être proposé, dans certaines situations, pour éviter la naissance de garçons malades.
Les principales indications du DPI sont celles du diagnostic prénatal, = maladies très graves, justifiant une interruption médicale de grossesse après diagnostic prénatal.
Actuellement nouvelles indications parmi lesquelles les maladies génétiques d’apparition tardive telles que la maladie de Huntington.
En France, seuls peuvent bénéficier d’un DPI les patients ayant préalablement réalisé un diagnostic présymptomatique révélant qu’ils ont hérité de leur parent atteint de la mutation causale (une expansion anormale de répétitions CAG dans le gène de la maladie de Huntington).
La sélection d’embryons sur la base d’un typage HLA est 1 nouvelle indication du DPI (anémie de Fanconi).


Documents de pathologie humaine du service d’anatomie pathologique du CFB de Caen et du CHPC de Cherbourg. L ’UTILISATION DES INFORMATIONS FOURNIES SE FAIT SOUS L’UNIQUE RESPONSABILITE DE L’UTILISATEUR. Les concepteurs et réalisateurs de cette base ne sauraient en aucun cas être tenus pour responsables des conséquences d’une utilisation non contrôlée des informations fournies.

Performed by Arnaud Legrand 2009 © All Rights Reserved.