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Biologie moléculaire et cancer du colon


Le HNPCC se différencie de la forme sporadique par l’âge plus jeune de survenue (moyenne 44 ans, de 14 à 82 ans), la prédominance dans le colon proximal (60 à 70%) et un risque accru de cancers colorectaux synchrones ou métachrones. Le risque de cancer colorectal est de 80% à 65 ans (6% dans population générale), le risque de cancer de l’endomètre est élevé (1), augmentation du risque de cancer de l’estomac et de l’ovaire, urothélial du bassinet, du grêle, risque plus faible de cancers de l’arbre biliaire, rein, SNC (syndrome de Turcot) ou de la peau (syndrome de Muir Torre) (2 ;3).
En consultation d’oncogénétique sont bons indicateurs de consultation puis d’analyse génétique, parmi les cancers extra-coliques, l’endomètre, l’uretère, le bassinet et le grêle,valeur prédictive positive moindre des cancers de l’estomac, voies biliaires, ovaire, on n’inclut pas le sein, prostate, poumon
Ce syndrome est transmis sur un mode autosomique dominant : Am J Clin Pathol. 2012 Jun ;137(6):847-59, 90 à 100% des cas sont dus à des mutations de gènes de réparation de mésappariements (RER ou Replication Error) ou MMR actuellement, sous forme de petites séquences répétées en tandem de 1 à 6 bases = microsatellites, aboutissant à une instabilité de microsatellites (MSI), 64 à 90% par atteinte de hMLH1 (MutL homologue) en 3p21.3 et de hMSH2 (MutS homologue) en 2p22-21, les autres mutations sont dues à hPMS1 (post meiotic segregation) en 2q31.33 et hPMS2 en 7p21 (4-7), sont impliqués également hMSH6, hMLH3.
Le phénotype MSI est détecté grâce à 5 microsatellites standards (BAT25, BAT26, D5S346, D2S123, S17S250), si > 2, la tumeur est MSI-H, si un seul, elle est MSI-L, si aucun elle est stable (MSS) (8). A coté du panel de référence de Bethesda, a été proposé un panel alternatif de 5 marqueurs microsatellites mononucléotidiques (BAT25, BAT26, NR21 NR24, NR27) plus sensible et d’utilisation plus rapide sous forme de PCR multiplexe Ann Pathol 2007:27:433
Comme près de 80% des instabilités microsatellites sont secondaires à la méthylation des séquences CpG de la région promotrice de MLH1 (événement somatique), on recherche la mutation V600E de BRAF Arch Pathol Lab Med. 2010 Aug ;134(8):1225-8 qui est présente dans 70 à 78% des cancers MSI secondaires à une méthylation (vs 7.6% si cancer MSS), absente dans les syndromes de Lynch Virchows Arch. 2013 Nov ;463(5):613-21. Le spécimen tumoral doit avoir une cellularité > 20% ainsi que du tissu normal, de préférence l’exérèse, mais également biopsie si cancer rectal avant radiochimiothérapie. La détection de V600E BRAF en IHC est très sensible et spécifique comparée à la biologie moléculaire
La détection peut aussi s’effectuer par immunohistochimie (9) (AJCP 2004 ;122:389 , N Engl J Med 2005 ;352:1851), (MLH1, MSH2 / 6, PMS2), + dans le noyau des cellules normales de l’ensemble des tissus et dans les cellules du stroma tumoral (témoins positifs internes), on recherche une perte d’expression dans les cellules tumorales).
A l’état normal, ces protéines sont exprimées dans le noyau des cellules du 1/3 < des cryptes, les CG des follicules lymphoïdes et par les lymphocytes et les cellules endothéliales du stroma de la tumeur (témoins internes positifs), mais le marquage est +/- irrégulier.
Perte d’expression de hMLH1 ou hMSH2 (sensibilité et spécificité de 90%) (10), voire MSH6 et PMS2. L’absence de perte d’expression se voit dans 5% à 8% avec mutation faux sens (surtout en MLH1) avec proténine non fonctionelle mais à antigénicité normale. Elle oriente l’analyse constitutionnelle, sauf dans le cas de la protéine MLHl dont l’extinction peut correspondre à une mutation germinale du gène MLHl ou à une inactivation par méthylation de son promoteur. Celle-ci est habituellement en rapport avec le vieillissement et s’accompagne le plus souvent dans l’ADN tumoral de la mutation V600E du gène BRAF qui est absente dans le syndrome de Lynch. La combinaison séquentielle de ces 3 analyses somatiques devrait permettre de réduire les indications d’analyse constitutionnelle des gènes altérés dans le syndrome de Lynch (Ann Pathol 2007:27:433).
La recherche par immunohistochimie du phénotype MSI a été effectuée depuis plusieurs années (11), pour certains l’immunohistochimie et l’analyse microsatellitaire sont un bon moyen de détection de HNPCC par rapport au séquençage de MLH1 et MSH2 (12). Mais les résultats sont conflictuels (test partiel de MMR (analyse de 2 protéines), toutes les mutations ne modifient pas l’épitope), alors que certaines études (4/15) montrent une sensibilité et spécificité proches de 100%, donc aussi efficace et moins cher que par biologie moléculaire (4/15 études) (13). Mais 7/15 études sont moins optimistes (14). En multi-institutionnel, l’immunohistochimie est moins spécifique car les protocoles ne sont pas standardisés et > 10% de discordance avec la PCR (15).
Règles d’interprétation : dans MSI on recherche une perte d’expression avec témoin interne +, en l’absence de témoin si négatif = non significatif, sur biopsie pb du faux négatif par hétérogénéité ou pb préanalytique (pb de fixation, hypoxie, post-traitement (MSH 6). Ou faux positif si protéine mutée détectée en Immunohistochimie, ou protéine normale résiduelle si allèle normal non délété.
Les délétions hétérologues de MSH6 en immunohistochimie sont rares, elle s’accompagne d’une perte complète de MLH1 ou PMS2, ou les 2, non associée à une mutation germinale de MSH6 Am J Surg Pathol. 2015 Oct ;39(10):1370-6.
Dans le carcinome colorectal, la présence d’une mutation BRAFV600E exclut un syndrome de Lynch si MSI. Dans les MSS une mutation BRAFV600E serait de mauvais pronostic (6.4% des cas Mod Pathol. 2014 May ;27(5):644-50), mais ne sort pas en multivariée.
Analyse constitutionnelle après résultat de l’analyse des cellules tumorales (génotype en premier lieu, et immunohistochimie pour les tumeurs MSI si possible). Celle-ci implique l’acceptation de l’analyse par la personne venue consulter qui doit être informée sur les limites des analyses, les conséquences médicales et non médicales attendues ou prévisibles d’un test positif ou négatif.
Actuellement, on recommande les analyses dans l’ordre suivant :
Analyse de la séquence codante des gènes MLH1 et MSH2 à la recherche de mutations ponctuelles. Arrêt et compte-rendu si une mutation délétère est identifiée.
Sinon poursuite de l’analyse par la séquence codante de MSH6 à la recherche de mutations ponctuelles et par une analyse de MSH2 à la recherche d’une anomalie complexe. Arrêt et compte-rendu.
Si la probabilité résiduelle de mutation délétère d’un gène MMR reste élevée (argument lié à l’analyse somatique par exemple), reprise ou complément d’analyse orienté par cet argument.
Le MSI n’est pas spécifique des cancers sur HNPCC/Lynch (vu dans 15 % des CCR sporadiques, surtout du côlon proximal chez des sujets > 60 ans, lié à une hyperméthylation du promoteur de MLH1 liée à la sénescence avec défaut d’expression de la protéine).
Les tumeurs RER + sont plus souvent diploïdes, prédominent au colon proximal, sont peu différenciés et colloïdes avec infiltrat lymphoïde marqué (16) et métastases ganglionnaires ou systémiques plus rares (17), globalement la survie est meilleure que celle des RER - (18), le risque est cependant élevé de second cancer HNPCC (colon, grêle, estomac, ovaire, rein, uretère, pancréas, voies biliaires). La meilleure survie semble plus liée à la diploïdie qu’à la nature MSI-H versus MSI-L ou MSS (19).
Le phénotype RER + décrit dans les CRC de type HNPCC, se voit aussi dans près de 15% des formes sporadiques et a été décrit aussi dans des carcinomes gastriques ou endométriaux (qui font partie du spectre HNPCC). En cas de cancer double colon et endomètre avec survenue du premier cancer avant 50 ans, le risque de MSI varie de 28 à 80% (20).
Les carcinomes MSI présentent la séquence suivante : mutations de Ki Ras, de la β caténine, des récepteurs de type II de TGF β ou de IGF (insulin growth factor), du gène Bax. Pour rappel ces CRC sont plus souvent diploïdes (21), de situation proximale (41% dans colon droit versus 5% dans rectum), plus souvents multifocaux (22), peu différenciés, de grande taille, mucosécrétants, chez des sujets plus jeunes avec une importante stroma réaction lymphoïde (pseudo Crohn) et lymphocytose intra épithéliale, une infiltration de type pushing type, à un stade plus précoce, sans nécrose sale (23) et associés plus souvent à des cancers du sein (24). L’immunohistochimie et l’analyse microsatellitaire sont un bon moyen de détection de HNPCC par rapport au séquençage de MLH1 et MSH2 . (25). A noter que les tumeurs hMLH1 sont plus souvent mucineuses et moins bien différenciées (36% et 70%) que les Ts hMSH2 (11% et 22%) (26), malgré ces différences, il n’est pas possible en histologie de prédire quelles tumeurs seront MSI (27). A noter dans ces tumeurs une diminution d’expression de CK20 (1/3 – versus 9% dans formes sporadiques) (28).
Une 3ème catégorie de tumeurs a été individualisée avec instabilité épigénétique ou CIMP (CpG Island Methylator Phenotype) par hyperméthylation du promoteur de certains gènes, elles représentent 20 à 30 % des carcinomes coliques = modèle festonné, car se voit surtout dans les adénomes festonnés sessiles , avec mutation de BRAF. Selon le gène inhibé par l’hyperméthylation, le carcinome peut être soit MSS = 60% ou MSI-H, = 40%, la plupart des CRC sporadiques MSI-H = 12% à 15% des CRC, resultent d’une inhibition épigénétique de hMLH1 par hyperméthylation
Voie d’ativation ilots CpG  : mécanisme important d’inactivation de genes suppresseurs (Curr Mol Med 2006 ;6:401, Cancer Metastasis Rev 2004 ;23:29). Les ilots CpG sont des regions de 500 à 2000 paires de bases, riches en dinucléotides répétés cytosine-guanosine en 5’ des gènes humains, la méthylation des résidus cytosine dans les zones promotrices et exons proximaux de ces ilots réprime la transcription
Dans la famille de ces malades, la stratégie de dépistage peut s’appuyer sur le diagnostic génétique qui permet de restreindre la surveillance médicale aux seuls porteurs de la mutation délétère. Dans les autres familles, celles où la mutation n’a pu être identifiée, la surveillance s’exerce comme si les sujets étaient porteurs de la mutation. Il en est de même en cas de refus du diagnostic génétique ou lorsque le résultat de celui-ci est en attente.
Lorsque les critères d’Amsterdam sont incomplets (notamment lors de la survenue d’un cancer chez un patient de moins de 50 ans ou en cas de réunion des critères d’Amsterdam 1 et 2), la présence du phénotype RER + dans la tumeur (cancer ou adénome) invite à rechercher la mutation constitutionnelle (29).
Voie d’ativation MYH  : Mutations des 2 copies du gene de réparation MUTYH / MYH , si mutation bi-allélique, presence e multiples adénomes (Hum Mutat 2006 ;27:1064), risque de dégénérescence maligne X 93, mais moins de 1% de cancers (Am J Hum Genet 2005 ;77:112)
En résumé  : Il existe 3 modèles de carcinognèse dans le cancer du colon.
Modèle conventionnel d’instabilité chromosomique) dit séquence adénome-carcinome, initié par l’inactivation de APC/bêta-caténine/Wnt, par mutation d’1 copie de APC gène suppressuer puis second événement avec inactivation du second allèle par délétion ou mutation additionnelle. Il s’ensuit une dysplasie des cryptes aberrants et des adénome précoces. Accumulation séquentielle de mutations de KRAS, DCC, SMAD4, p53. Près de 60% des CRC sur FAP suivent ce mod-èle conventionnel.
Modèle MSI (voir ci-dessus) près de de 2 à 7% des CRC
Modèle festonné  :
 La tumorigenèse des cancers colorectaux classiques présente une séquence adénome/carcinome avec mutations successives (APC, KRAS et TP53), ce sont des cancers aneuploïdes (70%) sans instabilité des microsatellites et sans méthylation de l’ADN (Meth-).
Les cancers diploïdes : avec instabilité des microsatellites (MIS : 15%) ou sans instabilité des microsatellites (MSS : 10%) et avec méthylation de l’ADN (Meth+)
Groupe 1 (Meth-/MSS)  : côlon gauche - rectum, prédominance masculine, répond au 5FU. Cytologie de type adénome, rarement mucineux, avec des aspects de ’budding’ (petits bourgeons tumoraux invasifs), de la nécrose sale, peu de TIL (lymphocytes intratumoraux) et expression nucléaire de la bêta-caténine.
Groupe 2 (MSI/Meth+) : dans le côlon droit (90%) plutôt chez la femme, lien avec l’âge et le tabagisme. Bon pronostic, ne répond pas au 5FU, souvent peu différencié, mucineux avec des TIL, une tendance expansive, des aspects festonnés et peu d’aspects de ’budding’, une expression membranaire de la bêta-caténine et des polypes festonnés associés.
Groupe 3 (Meth+/MSS) : côlon droit (60%), plus fréquent chez la femme. Il est agressif avec un âge d’apparition précoce et des antécédents familiaux. Il répond au 5 FU. Carcinome mucineux peu différencié d’aspect festonné, peu de lymphocytes, une infiltration diffuse et des polypes festonnés associés. La méthylation de l’ADN permet de prédire la réponse au 5FU.
Syndrome de Lynch (HNPCC) : côlon droit (60%), plutôt chez ’homme avec un âge d’apparition précoce et des antécédents familiaux, et souvent d’autres cancers.
Il s’agit de carcinomes mucineux peu différenciés avec des TIL (lymphocytes intratumoraux) et des phénomènes de ’budding’. Les adénomes sont rares.
Prise en charge des personnes asymptomatiques, indemnes de pathologie à risque de carcinome HNPCC
Côlon et rectum  : AINS : anti-COX2 et aspirine qui ont un effet protecteur démontré sur les adénomes et cancers colorectaux sporadiques (taille et nombre des lésions) ; le calcium a également un effet protecteur, plus modeste. Le dépistage des tumeurs colorectales par coloscopie présente un intérêt chez les personnes porteuses d’une mutation délétère d’un des principaux gènes MMR, comme chez les apparentés au 1er degré des personnes atteintes de CCR, dont l’histoire familiale répond à la définition clinique du syndrome HNPCC A débuter au plus tard à 25 ans, sans doute pas avant l’âge de 20 ans, et à répéter tous les 2 ans. On peut compléter l’examen en utilisant un colorant de type indigo carmin. La chirurgie d’exérèse colique ou rectale prophylactique ne peut être recommandée.
Endomètre  : aucun argument pour contre-indiquer un traitement oestroprogestatif ou un THS chez les femmes appartenant à une famille HNPCC. Pas de preuves d’efficacité du dépistage du cancer d’endomètre (échographie / hystéroscopie). Pas de recommandation d’hystérectomie prophylactique.
http://www.fmcgastro.org/wp-content/uploads/file/pdf/191.pdf

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