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cytométrie en flux


 
LA CYTOMETRIE EN FLUX
La cytométrie en flux (CMF) est actuellement une technique de recherche en pathologie tumorale, bien que ce soit une technique standard en hématologie (typage lymphocytaire). Son but en pathologie tumorale est d’évaluer le contenu en ADN des cellules ainsi que l’activité proliférative de la tumeur analysée. Plusieurs études ont été menées au service démontrant l’intérêt pronostique majeur de cette technique dans la thérapeutique du cancer du sein, malheureusement pour des raisons diverses et variées, compétition féroce dans les milieux scientifiques dans la course aux publications, méthode déjà ancienne et considérée à tort par de nombreux cliniciens (qui souvent ne maîtrisent pas du tout les outils méthodologiques permettant de juger ces techniques spécifiques) comme obsolète. Une surprime étant toujours accordée aux méthodes récentes ou en cours de développement et qui sont toujours riches en promesses souvent déçues par la suite.
Elle sert aussi aux équipes de recherche du centre, qui étudient les effets d’antimitotiques et de drogues anti-cancéreuses sur des cellules en culture. Des blocages du cycle cellulaire et des cellules en apoptose peuvent ainsi être mis en évidence.
Cette technique est réalisée en plusieurs étapes : dissociation, coloration, passage de la suspension dans le cytomètre et analyse des histogrammes obtenus.
Une surpression de l’ordre de 1 bar est exercée sur une suspension cellulaire colorée par un colorant fluorescent. Ce système permet aux cellules d’être positionnées verticalement par rapport à une source excitatrice (laser argon). Les signaux optiques, sélectionnés par des jeux de miroirs dichroïques et des filtres sélectifs sont récupérés par différents photomultiplicateurs (PMT). Les signaux électriques délivrés par ces PMT sont alors convertis en signaux analogiques et traités par un ordinateur puissant. Toutes les données sont ensuite rendues sur des histogrammes mono ou biparamétriques.
Le cytomètre mesure simultanément sur chaque cellule la diffraction axiale, celle à 90°, et 2 fluorescences de longueur d’ondes différentes (Annexe 11).
Le cytomètre comprend :
- un laser argon de 15 mW ;
- 4 détecteurs (1 photodiode pour la taille et 3 photomultiplicateurs pour les fluorescences) et des filtres spécifiques de chaque fluorescence ;
- une aiguille de prélèvement reliée à une seringue pouvant aspirer jusqu’à 200 µl d’échantillon ; le cytomètre est lié à un ordinateur qui visualise les histogrammes et permet le calcul de la phase S
Le cytomètre analyse en fonction de 3 paramètres : la taille des cellules (FS), la granulosité (SS) et la fluorescence (FL3).
Dans les échantillons de tumeur, la granulosité correspond à l’hétérogénéité de la chromatine des cellules et la fluorescence à la quantité d’ADN contenue dans leurs noyaux. Le filtre longpass 630 nm (fluorescence rouge) permet d’éviter la fluorescence naturelle des cellules (fluorescence verte).
Les différences de taille et d’homogénéité nucléaires sont illustrées par cette photo d’une lame de contrôle cytologique d’un cancer du sein grade III de Scarff et Bloom.
noyaux nus
 LA PROLIFERATION TUMORALE
La croissance tumorale comporte 2 étapes : apparition d'un clone tumoral, à partir d'une cellule "transformée", sous l'action d'agents carcinogènes initiateurs et promoteurs, la prolifération cellulaire aboutit à la constitution de la tumeur. Puis dissémination cancéreuse, à partir de la tumeur initiale développement de tumeurs secondaires (métastases), régionales, puis générales.
On considère qu'un cancer dérive d'une seule cellule "transformée" : théorie clonale. En fait, les cancers humains sont hétérogènes, constitués deplusieurs populationscellulaires, avec des aspects et propriétés différents (morphologie, caryotype, prolifération cellulaire, caractères antigéniques et immunogénicité, croissance in vitro, capacité métastatique, sensibilité à la chimiothérapie). Cette hétérogénéité reflète l'instabilité génétique des cellules cancéreuses avec apparition de sous-populations cellulaires dérivées du clone initial.
 
Lésions élémentaires de la mitose
Les cellules hyperspécialisées comme le neurone ou la cellule musculaire striée sont "postmitotiques" et ne se divisent plus. C'est essentiellement en pathologie tumorale que les anomalies de la mitose ont une importance majeure pour le diagnostic et le pronostic histopathologique. La mitose est impliquée dans des processus dystrophiques et inflammatoires.
Anomalies quantitatives : accélération des mitoses (tumeurs, mais aussi réparation, régénération tissulaire et hyperplasie). Le ralentissement des mitoses peut être physiologique, (stades terminaux de l'embryogenèse, sénescence tissulaire), il est pathologique dans l'atrophie (carence vitaminique, antibiotiques, hypovascularisation). L'examen d'une coupe histologique est un instantané, qui permet de quantifier le nombre de mitoses.
Anomalies qualitatives : troubles de fonction chromosomique variés : absence de partition, fragmentation anormale, chromosomes aberrants, chromosomes à deux centromères, chromosomes polaires, chromosomes en anneaux, etc...
Ces altérations aboutissent très souvent à une mitose abortive et la cellule ne peut survivre. Ces anomalies chromosomiques peuvent être reproduites par des radiations ionisantes ainsi que par des substances dites "radiomimétiques". Trouble de la fonction fusoriale, qui implique les microtubules. On observe un arrêt de la mitose en métaphase ou des fuseaux de forme anormale, en étoiles. Ces anomalies de la fonction fusoriale peuvent être reproduites par certaines substances dites poisons fusoriaux telle la colchicine et aussi certains alcaloïdes utilisés en carcinologie telle la vincristine ou la vinblastine.
 
Les cancers ont une vitesse de croissance très variable, d’où la notion de temps de doublementd'une tumeur, apprécié cliniquement (palpation, radiographie ..), dont l’évaluation est difficile, car les tumeurs sont mal limitées, le volume mesuré inclut le stroma, nécrose, hémorragies. De plus le temps de doublement varie au cours de l'évolution d'un cancer.
La vitesse de croissance dépend du nombre de cellules prolifératives, engagées dans le cycle cellulaire (phases S + G2 +M) par rapport aux cellules quiescentes(en G0) et des pertes cellulaires : par nécrose ou apoptose.
L’évaluation de l’activité proliférative fait partie intégrante de l’analyse histologique de tout prélèvement. Cette évaluation a deux buts :
1°) Concourir à l’établissement d’un diagnostic de tumeur bénigne versus maligne  : en effet , l’activité mitotique est un critère important dans l’établissement du diagnostic de malignité (la plupart des tumeurs malignes présentent une activité mitotique significative alors que les tumeurs bénignes en sont dépourvues) et ceci dans un grand nombre d’entités (ainsi par exemple une tumeur de type neurofibrome chez un patient porteur d’une neurofibromatose de type 1 de von Recklinghausen, avec une activité mitotique même mineure, doit être considérée comme un schwannome malin et traitée comme telle, il en est de même en ce qui concerne une tumeur musculaire lisse dans les tissus mous qui, si elle présente une activité mitotique faible, doit être considérée comme maligne). Ce critère n’est bien sûr ni suffisant ni obligatoire. En effet, certaines tumeurs malignes présentent une activité mitotique très faible, voire nulle [sein, (carcinome lobulaire infiltrant, carcinome tubuleux), prostate, sarcome de faible grade (sarcome fibromyxoïde ou sarcome myofibroblastique de faibles grade)], alors que des lésions régénératives ou des tumeurs bénignes (fasciite nodulaire, tumeurs des glandes endocrines) peuvent être le siège d’une activité mitotique importante.
2°) Effectuer un grade pronostique.
En fait le grade pronostique de nombreuses tumeurs n’inclut pas l’activité mitotique, soit parce que les tumeurs ne sont pas gradées (carcinome malpighien, carcinome pulmonaire, tumeur embryonnaire, adénocarcinome digestif, tumeur neuroendocrine), soit parce que le grade est purement morphologique (astrocytome, tumeurs rénales, tumeurs urothéliales, adénocarcinome prostatique), et ceci bien que la mise en évidence de mitoses concourt au diagnostic.
Parmi les tumeurs pour lesquelles l’évaluation de l’activité mitotique joue un rôle important dans les grades histologiques, on a en premier lieu les carcinomes mammaires (pour lesquels le plus grand nombre d’articles a été publié à ce sujet) mais également les tumeurs malignes gynécologiques d’origine mullérienne (le grade est surtout important dans les tumeurs bien différenciées), les sarcomes et certaines tumeurs malignes des glandes salivaires (carcinome muco-épidermoïde).
Dans d’autres tumeurs tels les mélanomes, l’évaluation de l’activité mitotique ne joue qu’un rôle mineur (indice de McGovern) la profondeur d’infiltration mesurée selon les critères de Breslow et Clark étant de loin le critère prédominant, dans les tumeurs urothéliales l’activité mitotique participe de façon implicite à l’évaluation du grade mais sans condition chiffrée précise.
En pratique, les deux tumeurs qui nécessitent en routine l’élaboration d’un grade de malignité où figure l’activité mitotique sont les tumeurs mammaires et les sarcomes.
Comment est évaluée l’activité proliférative ?
1°) Comptage des mitoses par le pathologiste.
Pour que ce comptage soit reproductible en particulier pour l’établissement des grades, celui-ci doit être effectué selon certaines conditions :
- les mitoses doivent être évaluées selon des critères précis pour ne pas inclure des nécroses, apoptoses et autres artéfacts (absence de membrane nucléaire, extension irrégulière du matériel nucléaire en agrégats soit dans un seul plan (métaphase et anaphase) soit en deux amas séparés (télophase).
- les mitoses doivent être comptées sur une surface d’environ 1,7 mm2 en focalisant la recherche sur la zone à la fois la plus cellulaire et la plus active mitotiquement, repérée au préalable au faible grossissement, ce qui correspond pour de nombreux microscopes, à environ 10 champs aux fort grossissement. Les champs doivent être consécutifs dans la mesure du possible en excluant des territoires nécrotiques, inflammatoires, fibreux, calcifiés.
Il a fallu plusieurs années pour arriver à un consensus sur ce sujet, en effet, la description classique de « x » mitoses/champ au fort grossissement ne veut pas dire grand chose, les champs pouvant varier d’un facteur allant jusqu’à 6 selon le microscope utilisé. Une telle évaluation était donc peu significative et surtout non reproductible d’un laboratoire à l’autre (réf Salder The Lancet).
L’équipe néerlandaise de Baak a beaucoup contribué à l’évaluation histologique de l’activité mitotique, en particulier dans le cadre des carcinomes mammaires.
Cette équipe a en effet montré, lors d’une étude coopérative néerlandaise incluant 15 centres et près de 2500 carcinomes mammaires, que l’évaluation de l’activité mitotique, en suivant les critères précisés ci-dessus, était reproductible avec un coefficient de corrélation élevé moyen de 0,91.
Cette équipe a aussi montré sur une série de près de 190 cas de carcinomes mammaires que cette évaluation de l’activité mitotique, qu’elle soit faite en échantillonnant 10 champs au hasard au sein de la tumeur (à l’aide d’une platine motorisée) ou de façon classique, en introduisant ou non une correction tenant compte du volume relatif de la tumeur par rapport au stroma, ne changeait rien aux corrélations entre l’activité proliférative et les autres facteurs du pronostic ainsi qu’avec le pronostic. Cette équipe a réussi à montrer que l’évaluation visuelle classique et donc plus ou moins subjective du fait du choix de la zone la plus active présentait les meilleures corrélations avec le pronostic.
Cette équipe a aussi démontré que les éventuels artéfacts dus à une fixation tardive, rendent l’interprétation et l’évaluation de l’activité proliférative plus laborieuse sans modifier cependant de façon significative les résultats, y compris en cytométrie en flux.
Cette méthode, non élaborée mais pratique, rapide et quasi gratuite puisqu’elle n’exige qu’un peu de temps et d’attention, a montré en particulier pour le sein qu’il existe une corrélation forte entre l’activité proliférative et les différents autres facteurs pronostiques classiques du sein (T, N, récepteurs, grades) ainsi qu’avec le pronostic et ceci dans une grande majorité des séries publiées.
2) Evaluation de l’activité proliférative grâce à l’immunohistochimie.
Certaines protéines sont exprimées durant le cycle cellulaire, parmi celles-ci, le Ki67 (Ac MiB1 utilisable en paraffine) est le plus étudié et utilisé, les Ac contre ces protéines permettent de marquer les noyaux entrés dans le cycle (NB : plusieurs études ont montré la supériorité du Ki67 sur le PCNA ou PC10).
Plusieurs méthodes d’évaluation du marquage sont utilisées. La plus utilisée est également la plus simple et « rustique » et consiste à compter la proportion de noyaux marqués par le pathologiste ce qui est une méthode tout aussi subjective que le dénombrement « standard » des mitoses effectué par le pathologiste. En effet cette méthode pose le problème des valeurs seuils à partir desquelles on considère qu’un noyau est marqué et exige de plus le dénombrement des noyaux non marqués ce qui est laborieux, les évaluations sont alors, hormis le cadre d’études bien spécifiques, semi-quantitatives.
Certaines unités de recherche, dont la nôtre au CFB, se sont engagées dans le développement de méthodes automatiques de quantification de réactions immunohistochimiques qui pourraient permettre une évaluation plus objective de la prolifération. Ces méthodes nécessitent cependant de puissants outils informatiques, permettant automatiquement d’échantillonner les champs à analyser, de séparer le stroma de la tumeur, d’évaluer la surface des noyaux (marqués vs non marqués).
Il existe des méthodes plus ou moins automatiques déjà développées sur des analyseurs d’images, mais qui sont malheureusement considérés comme obsolètes de nos jours (Cas 200, Samba 2005), sur ces appareils la segmentation des noyaux est effectuée de façon interactive par l’opérateur avec élimination manuelle par dessin sur l’écran des territoires non significatifs (nécrose, stroma)
En ce qui concerne l’évaluation immunohistochimique de l’activité proliférative, une méthode a été préconisée par marquage par la 5 iododésoxyuridine. C’est une méthode qui paraît prometteuse, mais qui exige des conditions particulières. En effet, pour effectuer une telle étude, il faut une perfusion de 24 heures d’une dose de 2,4 grammes d’IdU, le prélèvement ayant lieu entre 23 heures 30 et 24 heures 30 après le début de l’injection.
Les prélèvements tumoraux et témoin cutané sont fixés dans du liquide de Clark, inclus en paraffine, puis utilisés selon la technique anatomopathologique classique, avec une immunohistochimie, avec de l’anticorps anti-IDU et un comptage de noyaux marqués dans la tumeur et le stroma, en effectuant une réponse semi-quantitative.
Cette méthode, bien que prometteuse, n’est qu’une variante de la méthode au Ki67 sur le principe (immunohistochimie) et de la méthode au BrdU en pratique car exigence d’une collaboration très étroite avec un bloc opératoire motivé, ainsi que des programmes opératoires, qui se déroulent dans les temps impartis ainsi qu’un accord du Centre d’éthique. Il s’agit donc d’une méthode lourde limitée à des centres de recherche.
Sur le fond, cette méthode se rapproche beaucoup de l’évaluation de l’activité proliférative par le marquage aux anticorps PCNA, Ki 67, Mi B1 et comme ces dernières évalue la proportion de cellules en cycle et non seulement engagées en mitose.
D’après une revue de littérature, il s’avère que la méthode immunohistochimique n’a pas encore fait la preuve de sa supériorité par rapport au compte des mitoses, mais exige une technicité plus grande et des moyens techniques plus élaborées, avec donc un surcoût évident. En effet, des études comparant les différentes façons d’évaluer l’activité proliférative ont été effectuées essentiellement sur le sein, avec des résultats différents. Globalement, il existe une très bonne corrélation entre les différentes façons d’évaluer l’activité proliférative. Dans ces études, on retrouve cependant une supériorité du compte des mitoses, une étude ayant montré une supériorité de l’évaluation immunohistochimique de l’activité proliférative sur le simple compte de mitoses.
3) Evaluation de l’activité proliférative grâce à la cytométrie de flux(CMF)
Cette technique est utilisée en prospectif dans l’étude des tumeurs du sein et a fait à présent la preuve de son intérêt majeur. Le but est de connaître l’ADN ploïdie des cellules tumorales et de savoir quelle est la proportion de cellules en phase S.
Dans un organisme vivant, l’homéostasie tissulaire est assurée par le maintien de l’équilibre entre perte et prolifération cellulaire.
Les pertes cellulaires peuvent être naturelles par élimination de cellules différenciées (kératinocytes cutanés), apoptose (mort programmée) ou nécrose qu’elle soit en masse ou par ischémie.
La prolifération cellulaire intervient en compensation des pertes et son intensité est régulée par le nombre de cellules entrant en division.
Le cycle cellulaire comprend 4 grandes phases, différentes par l’état fonctionnel des cellules et leur contenu en ADN :
- phase G1 : la cellule différenciée, sous l’influence des signaux des cellules voisines, effectue les tâches spécifiques pour lesquelles elle a été programmée. Pendant cette période de synthèse protéique intense, le stock d’ADN reste stable à 2c ;
- phase S : la cellule duplique son ADN, sa quantité d’ADN passe donc de 2c à 4c en fin de phase ;
- phase G2 : la cellule en 4c synthétise les protéines indispensables à la mitose comme par exemple les tubulines du fuseau mitotique ;
- phase M : c’est la phase de mitose pendant laquelle il y a une hypercondensation de l’ADN en chromosomes (23 paires chez l’Homme), puis une répartition équitable du stock en 2 lots à 2c grâce à la mise en place du fuseau mitotique et enfin la scission de la cellule initiale en 2 cellules filles lors de la télophase.
Par opposition à ces 4 phases propres aux cellules cyclantes, il existe une autre phase, la phase G0 (même caractéristiques que G1 mais la cellule ne se divise pas). Il s’agit d’un état post-mitotique transitoire (cellules souches ou différenciées recrutables) comme pour les lymphocytes ou permanent (cellules vouées à une différenciation poussée puis à la mort cellulaire programmée à plus ou moins longue échéance) comme pour les neurones, hépatocytes, cellules musculaires et toutes cellules spécialisées.
LA LA MANIPULATION
Le médecin prélève, sur une pièce d’exérèse de tumeur, un fragment représentatif (nodule dense nacré et étoilé dans la plupart des cas).Le fragment prélevé est ensuite congelé en azote liquide (-196 °C).
Dissociation de la tumeur
Les différents fragments sont décongelés dans du tampon PBS, puis scarifiés au scalpel dans le but d’obtenir une suspension cellulaire la plus dense possible. Une fixation aurait empêché toute dissociation du fait de la coagulation des protéines qui rend les tissus durs. Les restes des tissus dissociés sont fixés en formol pour un examen histologique classique. Les lames seront lues par un pathologiste afin de confirmer le diagnostic de cancer sur le fragment analysé par cytométrie en flux.
Coloration
La coloration se fait en 2 temps, avec d’abord une perméabilisation des membranes plasmiques et nucléaires suivie d’une fixation sur l’ADN de l’iodure de propidium (colorant fluorescent). Les brèches crées permettent au colorant d’atteindre le noyau où il se fixera stoechiométriquement à la quantité d’ADN.
Cette partie de la manipulation est réalisée manuellement (toxicité de l’agent de lyse (à base de cyanure) et du pouvoir cancérigène du colorant).
Pour le développement de la coloration, les différents tubes de prélèvement sont filtrés (élimination des gros débris), mis à incuber à l’obscurité pendant 20 minutes. Ils sont ensuite placés au réfrigérateur (pour préserver les échantillons de l’autolyse).
Principes de l’appareil : Une suspension cellulaire ou de noyaux est envoyée sous pression dans une fine gaine à raison de 300 à 500 éléments/seconde devant un faisceau laser ou une lampe à arc. L’appareil collecte la lumière transmise aux faibles angles de diffraction (taille de éléments) ainsi qu’à angle droit (granulosité). La lumière fluorescente émise par le colorant intercalant et stoechiométrique (iodure de propidium, Hoechst, DAPI, bromure d’éthidium) passe par des miroirs dichroïques et aboutit dans plusieurs photomultiplicateurs qui permettent la digitalisation des informations. Ces données sont ensuite utilisées par les logiciels de la machine pour établir des histogrammes de distribution. D’autres logiciels permettent ensuite de calculer la ploïdie ainsi que la SPF (phase de synthèse).
Réglage du cytomètre en flux : Après la mise en route du cytomètre, on réalise d’abord plusieurs rinçages (à l’eau de Javel puis avec un détergent) pour enlever toutes les particules pouvant rester de la dernière utilisation.
Il faut ensuite placer le laser bien perpendiculairement à la cellule d’écoulement. Pour cela, on joue sur la mollette du laser de façon à obtenir un nuage de points le plus petit possible avec des billes calibrées en taille et en fluorescence.
On procède ensuite à un calibrage du cytomètre avec une suspension cellulaire provenant d’un adénofibrome (tumeur bénigne constituée de cellules ADN diploïde) qui sert de référence aux calculs de quantification de l’ADN et au placement des différents curseurs permettant de visualiser les pics d’un cycle ADN diploïde.
Après tous ces réglages, le cytomètre est prêt pour le passage des cas du jour où on peut observer plusieurs types d’histogrammes :
- diploïde : histogramme normal obtenu avec l’adénofibrome ou histogramme de tumeur ADN diploïde présentant un pic en position 2c (valeurs autorisées entre 1,9 et 2,1c). Il est toujours présent mais différemment représenté ;
- hypoploïde : présence d’un pic < 2c contenant plus de 10 % de l’effectif total ;
- neardiploïde : pic juste au dessus de 2c, contenant plus de 10 % de l’effectif total (valeurs autorisées jusqu’à 2,3c) ;
 -aneuploïde : un pic différent de 2c contenant plus de 10 % de l’effectif total
- tétraploïde : pic en position 4c contenant plus de 15 % de l’effectif total ;
- multiploïde : présence de plusieurs pics différent de 2c.
Réalisation de contrôles de qualité : Une goutte de suspension cellulaire est étalée sur lame, fixée en alcool-éther (éther et éthanol à 95° à volume égal) puis colorée selon Papanicolaou. Ces lames permettront de vérifier que les cellules analysées étaient bien des cellules tumorales et que la suspension cellulaire ne contenait pas trop de lymphocytes ou de cellules du tissu sain, qui augmentent artificiellement le nombre de cellules 2c.
En fin de série, on repasse le témoin (adénofibrome) pour valider la manipulation. Il doit se trouver au même endroit qu’au début de la manipulation.
Calculs de la phase S : Les informations enregistrées par le cytomètre sur son disque dur, sont ensuite traitées sur un logiciel (MultiCycle AV). Ce logiciel va calculer la phase S, l’indice d’ADN et réaliser un test du c2 (confiance pouvant être donnée aux résultats).
Exemple de calcul de phase S d’un cycle aneuploïde.
 
 
CMF
 
 
 
 
 
Cycle diploïde
Cycle aneuploïde
Phase S
Plusieurs études ont été réalisées au service qui démontrent que l’activité proliférative est le facteur le plus important après le statut ganglionnaire (voir sein carcinome canalaire-traitement).
Cytométrie de flux avec BrdU (ou IdU) : Le BrdU est un analogue de la thymine rapidement métabolisé in vivo, qui permet d’estimer le labelling index (LI), la durée de la phase S et le temps de doublement potentiel (T pot). Les suspensions cellulaires obtenues après marquage au BrdU subissent une dénaturation de l’ADN (ce qui permet l’action de l’Ac antiBrdU) et sont traitées par RN ase et colorées par iodure de propidium, qui est un colorant intercalant du DNA. Les cellules en phase G1-G2 n’ont pas incorporées le BrdU, avec un contenu en DNA de 2 et 4 n et les cellules en phase S, qui incorporent le BrdU sont reconnues par l’anticorps spécifique. L’intensité du marquage est d’autant plus important que la synthèse d’ADN est rapide ou l’incorporation du BrdU plus longue.
Méthodologie : le calcul du T pot nécessite deux mesures :
–Le pourcentage des cellules situées en phase S, qui est le LI ;
–Le temps mis par les cellules pour effectuer la synthèse du DNA, qui est le temps de phase S ou TS.
Le temps potentiel de doublement est T pot = TS/LI x l, l étant le facteur de compensation des variations de distribution des cellules dans le cycle.
Sur un histogramme, dont le marquage au BrdU et le prélèvement sont contemporains, la population marquée est répartie de façon symétrique et homogène entre G0 et G2. Le mouvement relatif ou MR est égal à 0,5, car les cellules marquées se trouvant à tous les stades de la phase S.
Si marquage au temps T0 et prélèvement au temps TE, la population qui a fixé le BrdU a le temps de « bouger » dans le cycle, plus on s’éloigne du moment de l’injection, plus la population poursuit son évolution. Certaines cellules entrent en mitose et réapparaissent après le temps de la mitose en début de cycle en nombre double. La population se rapproche donc de G2M. Le LI n’est calculé que sur la totalité de la population en B2 et la moitié de la population en B1. Le mouvement relatif RM au temps TE est à nouveau calculé par le poids moyen des cellules marquées restées dans le cycle, celui-ci sera situé entre 0,5 et 1.
En admettant que le mouvement relatif de ces cellules marquées soit linéaire, on peut par extrapolation estimer TS, qui correspond au temps mis par les cellules en G1, au temps 0 pour atteindre G2, avec donc un MR égal à 1.
TS = RMT0 X TE
 RMTE – RMT0
Bien que le principe soit assez simple, la pratique est bien plus difficile. Il faut un accord du Comité d’éthique local pour l’injection du BrdU, la participation active de l’équipe chirurgicale ( motivée ) pour que les injections de BrdU soient effectuées dans des délais raisonnables. L’étude des histogrammes est beaucoup plus compliquée en pratique qu’elle ne l’est sur le schéma ; en particulier, le MR est difficile à définir surtout si les populations sont multiples comme en cas d’aneuploïdie, ce qui fait que cette méthode qui est lourde ne s’est jamais vraiment mise en place et qu’elle est actuellement abandonnée tout comme la cytométrie en flux, les efforts se portant sur le DNA array, dont le principe peut sembler séduisant, mais dont les chances de percer malgré les énormes moyens financiers en jeu, sont minces, pour des questions de reproductibilité, en effet chaque laboratoire cherche à imposer ses puces, dont les composants sont toujours choisis de façon +/- aléatoire.


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