» Laboratoire de pathologie Fixation

Fixation


Principes de la fixation : La fixation inhibe l’autolyse, quand une cellule meurt la membrane des lysosomes est détruite les enzymes digestives cathepsines sont libérées dans le cytoplasme. La fixation empêche la putréfaction (destruction des tissus par les microorganismes certains appartiennent à la flore normale cela donne un phénomène équivalent à l’autolyse et il peut y avoir libération de gaz qui entraîne la formation de microcavités donnant un aspect de vacuolisation). Elle rend le tissu capable de supporter les traitements ultérieurs avec un minimum de déformations. La fixation fige les molécules in situ, notamment les antigènes, et préserve l’aspect structural du tissu.
Ele peut entrainer d’autres effets : solidification du matériel colloïdal par réticulation du gel cytoplasmique gênant la diffusion des réactifs à l’intérieur du tissu.
Les fixateurs peuvent ainsi inhiber plus ou moins les immunoréactions par modification des antigènes en changeant leur affinité pour les anticorps.
Artefacts de fixation : durcissement des tissus, modification du volume des tissus, modification des affinités tinctoriales des tissus (mordançage), fluorescence indésirable, pigments (formolés).
L’indice de réfraction des cellules est homogène, de l’ordre de 1.35. On ne peut donc pas les différencier sur des coupes fraîches non colorées, la fixation peut modifier l’indice de réfraction des cellules, on pourra les différencier avant toute coloration.
La fixation : fait intervenir des substances qui réagissent chimiquement avec les constituants des cellules et des tissus (insolubilisation des protéines par liaisons intermoléculaires). Elle maintient les structures (tissulaires, cellulaires et moléculaires) dans un état proche du vivant, empêche la fuite des petites molécules dans les solvants. Elle permet et favorise les techniques de marquage, en particulier les colorations. On dispose de différents types de fixateurs, classés selon leur mode d’action.
Dénaturation par méthode physique : chaleur, microondes dessiccation.
Méthode chimique avec des solvants organiques alcool, acétone, sprays… qui agissent comme agents déshydratants (dénaturation)
Fixateurs chimiques additifs : les lipides complexes liés aux protéines peuvent être conservés par les fixateurs additifs. Les triglycérides et esters de cholestérol conservés par le formol, sont extraits par les solvants organiques, alcool-acétone, éther (fixateurs dénaturants) et toluène, xylène qui interviennent lors de la technique de préparation des blocs. Leur étude passe par la congélation.
Fixation des acides nucléiques : conservés par les fixateurs dénaturants mais parfois fragmentés. Ils sont hydrolysés par les acides. Le formol crée un pontage de l’ADN avec les histones ; qui sont moins stables que les pontages protéines-protéines (propriété utilisée lors des techniques d’immunoprécipitation chromatinienne).
Fixation des protéines qui forment un réseau 3D autour duquel on conserve d’autres molécules. Il est essentiel de bien les fixer pour conserver une bonne morphologie. Il faut inactiver les enzymes responsables de l’autolyse.
Les fixateurs dénaturants : modifient la structure tertiaire des protéineset inactivent les sites enzymatiques et préservent les sites antigéniques, ils insolubilisent les protéines.
Parmi les méthodes de fixation dénaturantes physiques : dessiccation par simple séchage, lyophilisation ou évaporation lente, sous vide, de la glace, contenue dans l’échantillon congelé, chaleur (cocotte minute, micro-ondes) pour démasquer les sites antigéniques sur les coupes déparaffinées avant immunohistochimie.
Les fixateurs déshydratants : l’eau maintient en solution les constituants cellulaires, dont les protéines. Si l’on enlève l’eau, les protéines "collent" entre elles (leurs charges ne sont plus neutralisées par le dipôle de l’eau) : la structure du tissu est ainsi figée. Les solvants déshydratants permettent l’inclusion en milieu hydrophobe, souvent après passage dans d’autres fixateurs, avec élimination des molécules solubles non fixées.(lipides).
La dénaturation d’une protéine par élimination de l’eau modifie sa structure tertiaire, la molécule peut exposer ses sites hydrophobes vers le solvant
L’éthanol > 80% : dénature les protéines avec coagulation. Une déshydratation sans dénaturation protéiques est observée à -15°C L’éthanol est utilisé en mélange avec du formol ou même seul pour fixer les frottis.
L’acétone (CH3-CH3=O) : utilisé pour la fixation des coupes à congélation, avant marquage en immunofluorescence et permet l’extraction des lipides favorisant ainsi la mise en évidence des antigènes membranaires. Comme l’éthanol, l’acétone provoque un déformation de la structure des protéines qui peuvent exposer leurs sites hydrophobes vers le solvant.
Métanol (CH3-OH) : Action similaire à l’éthanol, comme l’acétone et l’éthanol il provoque un durcissement important des tissus les rétracte.
Acide picrique précipite les protéines, cette molécule polaire se fixe par son oxygène négatif sur des molécules chargées positivement et modifie leur solubilité, elle Inhibe la TAQ polymerase et casse les molécules d’ADN par création de lien entre les histones qui entourent l’ADN et empêche la biologie moléculaire.
Acide acétique (CH3-O2H) : précipite les acides nucléiques et améliore ainsi l’aspect des noyaux. On le trouve dans la composition de plusieurs fixateurs (Bouin, Carnoy…) On l’utilise en solution à 5% en mélange pour ses effets de gonflement et de tolérance (ne durcit pas les tissus), lorsque l’on veut contrecarrer les effets de fixateurs qui rétractent ou durcissent
Les fixateurs additifs : créent des ponts intra- et inter-moléculaires, immobilisant les molécules.
Aldéhydes (contraction de alcool déshydrogéné). Ils ont pour formule générale R-CH=O). Ils réagissent essentiellement avec les groupements aminés des protéines. Les plus couramment utilisés sont le formaldéhyde, (formol), le glutaraldéhyde (en microscopie électronique).
Formaldéhyde : H C=O-H : Il réagit avec les composés avec 1 hydrogène actif : les groupes amine (R-NH2), imine (R-COH-NH2), hydroxyle (R-OH), carboxyle (R-CO-OH), sulfhydryle (R-SH), pour former des ponts méthylène entre les chaînes protéiques et à l’intérieur même d’une protéine
La plupart des réactions entre formol et protéines sont réversibles une partie du formol reste fixé aux protéines (groupes aminés)
Effet des aldéhydes sur les protéines : réaction fonction amine et aldéhyde : CH2=O + R-NH2 = R-NH-CH2-OH + R’-NH2 = R-NH-CH2-NH-R’ + H2O donc formation de ponts méthylène entre 2 amines. Le formol peut réagir avec les chaînes latérales des résidus Lys Arg His Cys. La proportion des espèces peptidiques évoluent avec le temps jusqu’à atteindre des formes de plus en plus modifiées peut aller jusqu’à disparition des peptides intactes. Le formol accentue la basophilie des structures.
Le formaldéhyde réagit avec certaines amines pour donner des composés fluorescents dont la longueur d’onde d’émission varie selon les protéines fixées.
Cette fluorescence peut gêner l’interprétation des réactions d’immunofluorescence.
Le glutaraldéhyde C5H8O2 : en protocole standard de fixation en microscopie électronique car préserve bien l’ultrastructure cellulaire, puis postfixation au tretroxyde d’osmium. IL entraîne un fluorescence jaune-vert avec les filtres pour la fluoresceine et rouge-orange avec les filtres pour la rhodamine (due aux liaisons imines C=N car disparaît si on réduit ces doubles liaisons. Le glutaraldéhyde n’inhibe les réactions Ag-Ac et peut être utilisé en mélange avec du formaldéhyde en immunohistochimie.
Le tétroxyde d’osmium Os-O4 : agit surtout sur les doubles liaisons des lipides insaturés. Il peut être utilisé pour des fixations en vue d’un marquage immunohistochimique. Il inhibe la fluorescence due au glutaraldéhyde. Il provoque un noircissement des structures et peut entraîner un échauffement lors de la polymérisation.
Formol tamponné : pénètre rapidement de façon continue avec léger durcissement des tissus ce qui est un avantage pour la dissection, très bon fixateur tissulaire, peu déshydratant (limite les déformations).Les pièces peuvent y rester assez longtemps sans altérations majeures. C’est un assez mauvais fixateur cellulaire pas d’étude des grains. C’est un fixateur de faible coût. A température et pression du laboratoire le formol est un gaz incolore et inflammable. Dns le commerce en solution saturée dans l’eau (à 40%) on l’utilise à 10% de la solution mère soit 4%. Il polymérise en paraformaldéhyde, aussi les solutions du commerce sont stabilisées par 10% à 20% de méthanol On peut le préparer extemporanément à partir de paraformaldéhyde par débobinage à chaud du polymère. On l’utilise en solution tamponnée
Contraintes liées aux variations du pH : Le pH a un rôle essentiel au niveau des protéines avec polymérisation, minimum de solubilité à pHi et en conformation car la charge varie avec le pH : en milieu acide, les protéines s’ionisent comme des bases et sont chargés positivement. En milieu alcalin, elles forment des anions, le pH des solutions est maintenu pour conserver des valeurs proches de celles du milieu vivant étudié, par des systèmes tampons (mélange de substances ionisées susceptibles de fixer les ions H+ dans le milieu). Le formol pénètre le prélèvement à une vitesse de 1mm à 1,5mm/ heure.
La congélation : permet une conservation des tissus par immobilisation par le froid. Intérêt en histologie : conservation des sites antigéniques, durcissement rapide des tissus pour coupe de qq µ. Etudes de tissus qui ne supportent pas d’agents déshydratants. Congélation immédiate dans N2 liquide -196°, car une congélation lente (-30°C) endommage les tissus par formation de micro cristaux de glace avec artéfacts d’architecture par hyper tonicité du milieu intercellulaire de plus en plus marquée au fur et à mesure de la croissance des cristaux, il faut limiter la caléfaction = phénomène d’isolation thermique d’un liquide par rapport à une surface chaude ayant atteint une température seuil Ts supérieure à la température d’ébullition du liquide Te. Ce phénomène est dû à la formation d’une couche de vapeur entre la surface chauffante et le liquide, rendant le Transfert thermique beaucoup plus lent. Pour limiter les effets de caléfaction on congèle dans l’isopentane préablement refroidi en donnant un mouvement de rotation à l’échantillon pour évacuer le nuage de vapeur créé au contact du liquide froid et favoriser le gradient thermique entre l’acier chaud et le liquide de congélation.
Cette méthode permet une congélation plus RAPIDE et plus HOMOGENE
Du fait de la biologie moléculaire le fixateur le plus universellement utilisé reste le formol, malgré les risques professionnels encourus, car aucune alternative réaliste, pratique ou inoffensive n’existe à ce jour
Le formol à 30 % est obtenu par dissolution dans l’eau jusqu’à saturation de formaldéhyde gaz, et stabilisé par adjonction de 10 % de méthanol qui participera donc également à la fixation. En solution aqueuse, le formaldéhyde s’hydrate rapidement pour former du méthylène-glycol qui constitue le principal composant des solutions de formol. Cette réaction est réversible : au fur et à mesure que le formol se fixe au sein des tissus, de nouvelles molécules de formaldéhyde sont produites à partir du méthylène-glycol. Par ailleurs, le formol s’oxyde rapidement à l’air avec production d’acide formique (qui provoque la précipitation de granules noirâtres (pigment formolé) dans les tissus riches en hémoglobine) d’où la nécessité de le tamponner. Il faut utiliser des solutions de paraformaldéhyde fraîchement préparées si l’on souhaite, pour un travail défini, standardiser les conditions de fixation.
Le formol pénètre rapidement les tissus mais les fixe lentement. La pénétration tissulaire est favorisée par sa faible masse relative avec une constante de pénétration pratiquement identique pour les solutions de 8 à 30 %. Si la diffusion du formol dans les tissus est rapide, elle reste quand même conditionnée par l’épaisseur des fragments, comme le démontre la cinétique de fixation d’un cube de tissu hépatique de Icm dans une solution de formol à 10 % à température ambiante. La fixation est par contre un processus lent, qui s’effectue par l’établissement de liaisons covalentes inter et intra moléculaires avec les protéines, glycoprotéines, polysaccharides et acides nucléiques.
Un prélèvement fixé moins de 12 heures dans le formol, sera partiellement fixé par le méthanol stabilisant la solution et l’alcool ou l’acétone lors des étapes de déshydratation qui précèdent l’inclusion en paraffine. Rôle de la température sur la rapidité de la fixation qui explique l’efficacité des micro-ondes. Après quelques heures de fixation (4 à 5 heures) le formol diffuse dans toute l’épaisseur d’un fragment de petite taille. Le passage au micro-ondes accélère de façon considérable la cinétique de fixation par la chaleur générée.
Le formol ne provoque pas de durcissement exagéré, ne colore pas les tissus qui sont progressivement blanchis, il permet toutes les colorations usuelles, c’est un fixateur "fin" qui autorise même l’examen en microscopie électronique.
II maintient mal les substances solubles (mauvais fixateur du glycogène), est moins adapté à certains types de tissus (en particulier lymphoïdes et myéloïdes).
De nombreux autres fixateurs ont été utilisés auparavant, qui ont perdu tout leur intérêt depuis l’immunohistochimie (plus de nécessité d’analyse morphologique très précise)
Le liquide de Bouin (solution aqueuse de formol et d’acide acétique, additionnée d’acide picrique à saturation incompatible avec la biologie moléculaire). Des fixateurs dérivés du Bouin : Duboscq-Brasil (Bouin alcoolique), Gendre (Bouin alcoolique avec acide picrique à saturation), le meilleur fixateur du glycogène, Bouin Hollande (Bouin + acétate de cuivre) ; il permet de bonnes colorations cellulaires, en particulier du tissu myéloïde. Le Carnoy (alcool + chloroforme + acide acétique) ; nécessaire à la coloration de l’ADN et de l’ARN par le vert de méthyle-pyronine.
Le Zenker (sublimé et bichromate de potassium + acide acétique) :meilleur fixateur pour la cytologie hématologique.
La fixation doit toujours utiliser une quantité suffisante de fixateur (5 à 10 fois le volume de la pièce). Tous les fixateurs provoquant un durcissement des pièces, le récipient utilisé ne doit pas les déformer et permettre leur extraction (intérêt des sacs en matière plastique souple... étanches).
Il est utile aussi de débarrasser les pièces des matières organiques qui consomment inutilement du fixateur (sang, matière ; fécales, bile...).
La fixation se développant à partir des surfaces en contact avec le fixateur, il faut favoriser sa pénétration : en ouvrant les organes creux (tube digestif), en injectant le fixateur (dans les bronches, par exemple pour le poumon), en pratiquant des sections dans les organes pleins (rate rein, foie, ganglions...).
Certains organes ou tissus doivent être fixés dans des conditions particulières. L’encéphale est fixé en masse sans section préalable de la pièce fraîche, trop fragile. Les biopsies musculaires ne doivent être fixées qu’après un délai d’attente d’environ 10 minutes, pour éviter des artéfacts de contraction ; l’échantillon peut être placé sur une surface de bristol (jamais sur une surface absorbante, sur tout pas sur une compresse) et laissé à l’air, avant de plonger le tout dans du formol. L’utilisation d’un support est nécessaire aussi pour éviter la déformation des lambeaux de muqueuse jéjunale, qui doivent être étalés sur un bristol ou une grille de plastique (contact par leur face profonde) avant d’être plongés dan le fixateur.



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